蔣國(guó)君，劉天旭，黃桂紅，巫 亭，陶麗群，朱釗銘

(桂林醫(yī)學(xué)院1.臨桂臨床醫(yī)學(xué)院，2.第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541199)

異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞中Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的干預(yù)作用

蔣國(guó)君1，劉天旭1，黃桂紅2，巫 亭1，陶麗群2，朱釗銘2

(桂林醫(yī)學(xué)院1.臨桂臨床醫(yī)學(xué)院，2.第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541199)

目的研究異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞中Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的干預(yù)作用。方法采用異槲皮苷(0、40、80、160、320 μmol·L-1)作用于HepG2細(xì)胞，MTT法檢測(cè)異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響；倒置顯微鏡下觀察24、48 h后，細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)異槲皮苷(0、40、80、160 μmol·L-1)作用HepG2細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期情況；熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)異槲皮苷作用HepG2細(xì)胞后Ras、Raf、MEK、ERK mRNA及相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用，且與異槲皮苷的濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)；不同濃度的異槲皮苷作用HepG2細(xì)胞24、48 h后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生存數(shù)量逐漸減少，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著異槲皮苷濃度的增高，細(xì)胞被阻滯在G1期的數(shù)量逐漸增加；熒光定量PCR及Western blot結(jié)果均表明，與空白組相比，異槲皮苷(80 μmol·L-1)作用HepG2細(xì)胞后Ras、Raf、MEK、ERK mRNA及其相關(guān)蛋白的表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論異槲皮苷有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與對(duì)Raf/MEK/ERK信號(hào)通路中相關(guān)因子的干預(yù)有關(guān)。

異槲皮苷；誘導(dǎo)；HepG2細(xì)胞；Raf/MEK/ERK；信號(hào)通路；凋亡

肝癌是一種常見(jiàn)的世界性惡性腫瘤，發(fā)病率與病死率極高，危害性極大。目前，臨床上針對(duì)肝癌的治療手段主要包括外科手術(shù)、化療、放療以及肝移植等，這些治療手段都有明顯缺陷，如預(yù)后差、副作用大[1]。因此，肝癌病人迫切需要尋找具有有效抗癌作用的新型治療藥物。異槲皮苷存在于大量的中草藥、植物及食物當(dāng)中，具有抗氧化、降血壓、抗炎、抗腫瘤及抗惡性細(xì)胞增殖的作用[2-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)異槲皮苷具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的功能，但其具體的分子機(jī)制尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞水平探討異槲皮苷對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的分子機(jī)制，為異槲皮苷治療肝癌的研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所；異槲皮苷購(gòu)自Spring&autumn公司(純度≥98%，批號(hào):482-35-9)；Ras、Raf、p-Raf、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；熒光定量PCR試劑(批號(hào)：RR420A)、TRIzol(批號(hào)：9108)購(gòu)自日本TaKaRa公司；血清(胎牛)購(gòu)自ExCell Bio公司(批號(hào)：11E074)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司(批號(hào)：8114351)；Ras、Raf、MEK、ERK、β-actin上下游引物和探針由InvitrogenTM公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2方法

1.2.1MTT檢測(cè)異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板中(每孔2×103個(gè)細(xì)胞)，置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，用培養(yǎng)基將異槲皮苷按下列濃度稀釋?zhuān)瞥?、40、80、160、320 μmol·L-1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h，在檢測(cè)前4 h，每孔加入制備好的MTT溶液20 μL，置37℃、含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱避光繼續(xù)孵育，4 h后棄去各孔上清液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，將96孔板置于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，測(cè)定各孔OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，按公式分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率IR/%=(OD藥物組- OD0組)/(OD空白組-OD0組)×100%，求出半數(shù)致死率IC50。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，吸棄上清，用培養(yǎng)基將異槲皮苷按下列濃度稀釋?zhuān)瞥?、40、80、160、320 μmol·L-1，分別培養(yǎng)24、48 h后，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

1.2.3流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，分別加入異槲皮苷，使其終濃度為0、40、80、160 μmol·L-1，培養(yǎng)48 h后，用0.25%胰酶收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入預(yù)冷的0.1 mol·L-1PBS洗滌1次，以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清后，使用1 mL PBS重懸，加入2 mL預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定30 min。上機(jī)前收集所有固定標(biāo)本，離心棄上清，用PBS清洗1次，加入PI染液，室溫下避光染色30 min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.2.4熒光定量PCR檢測(cè)Ras、Raf、MEK、ERK相關(guān)基因mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，分別加入異槲皮苷及空白培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。TRIzol一步抽提法提取總RNA，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用15 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：Ras上游引物: 5′-GGCAAGAGTGCCTTGACGAT-3′, 下游引物: 5′-TTGACCTGCTGTGTCGAGAA-3′; Raf上游引物：5′-CTCCTTGAATCGGGCTGGTT-3′, 下游引物: 5′-TGGACAGGAAACGCACCATA-3′; MEK上游引物: 5′-TGTGAAGGCGCTGTACTACC-3′, 下游引物: 5′-CAGGATGTTGGAGGGCTTGA-3′; ERK: 上游引物5′-GGCTGTTCCCAAATGCTGAC-3′, 下游引物:5′-TTGAATGGTGCTTCGGCGAT-3′; 內(nèi)參β-actin作為對(duì)照, 上游引物: 5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′, 下游引物: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。反應(yīng)體系包括SYBR 7.5 μL，H2O 6.9 μL，cDNA 0.2 μL，引物0.4 μL。反應(yīng)條件為：95℃，30 s；95℃，5 s→60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；65℃→95℃，5 s，0.5℃/循環(huán)。

1.2.5Western blot檢測(cè)Ras、Raf、MEK、ERK相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)作用同上，作用48 h后收集細(xì)胞，提取2組細(xì)胞的總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加熱變性后-20℃保存。取各組細(xì)胞的總蛋白質(zhì)70 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉液封閉濾膜4 h，加入適量一抗(Ras：1 ∶50 000，Raf：1 ∶5 000，p-Raf：1 ∶5 000，MEK：1 ∶20 000，p-MEK：1 ∶20 000，ERK：1 ∶10 000，p-ERK：1 ∶10 000，β-actin：1 ∶1 000)4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，按1 ∶1加入AB發(fā)光液，在Bio-Rad的化學(xué)發(fā)光成像儀上成像，用圖像分析軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，分析出Ras、Raf、MEK、ERK相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

Fig 1 The growth effect of HepG2 cells treated with isoquercitrin

2.2異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響如Fig 2所示，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)異槲皮苷作用細(xì)胞時(shí)間一定時(shí)，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，與空白組相比，隨著濃度的升高，可見(jiàn)形態(tài)發(fā)生變化的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，且存活的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，即貼壁的長(zhǎng)梭形細(xì)胞減少，而懸浮的圓形細(xì)胞逐漸增多；當(dāng)藥物濃度一定時(shí)，隨著異槲皮苷作用時(shí)間的延長(zhǎng)，可見(jiàn)的形態(tài)發(fā)生變化的細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多，且存活的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。

2.3異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響Fig 3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞周期被阻滯在G1期的細(xì)胞百分比值逐漸增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞中Ras、Raf、MEK、ERKmRNA表達(dá)的影響Fig 4熒光定量PCR結(jié)果顯示，與空白組相比，異槲皮苷組Ras、Raf、MEK、ERK mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig2IsoquercitrininhibitsHepG2cellproliferationobservedbyinvertedmicroscopy(n=3)

A: The morphological changes of HepG2 cells treated with 0, 40, 80, 160 or 320 μmol·L-1of isoquercitrin after 24 h or 48 h were observed by inverted microscopy; B: Percentage of cell proliferation after isoquercitrin(0, 40, 80, 160 or 320 μmol·L-1) treated HepG2 cells for 24 and 48 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 3 Effect of isoquercitrin on cell cycle distribution in HepG2 cells(n=3)

A: Control; B: Isoquercitrin 40 μmol·L-1; C: Isoquercitrin 80 μmol·L-1; D: Isoquercitrin 160 μmol·L-1; E: Isoquercitrin(0, 40, 80, 160 μmol·L-1) blocks HepG2 cell cycle in the G1phase.*P<0.05vscontrol

Fig 4 Isoquercitrin inhibits Ras, Raf, MEK,ERK mRNA expression levels in HepG2 cells(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.5異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞中Ras、Raf、MEK、ERK及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，異槲皮苷組Ras、p-Raf/Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/ERK1蛋白表達(dá)的相對(duì)比值明顯降低，表明異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞中Ras、Raf、MEK、ERK相關(guān)蛋白的表達(dá)具有下調(diào)作用(P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

中草藥因其資源豐富、毒副作用小、能夠調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等優(yōu)點(diǎn)已成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)，中草藥抗腫瘤治療也越來(lái)越受到人們的關(guān)注[7]。異槲皮苷可以從多種中草藥中提取，如鬼針草、荷葉、紅景天以及桑葉等，也可化學(xué)合成制得[8-10]。因其廣泛的生物活性，如抗氧化、改善心肌功能、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血壓、降血脂等作用而備受關(guān)注，本課題前期研究也發(fā)現(xiàn)異槲皮苷具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的功能。

Fig 5 Isoquercitrin inhibits protein expression levels of Ras, Raf, MEK, ERK in HepG2 cells(±s,n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Ras是小分子量G蛋白家族成員之一，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化，還影響細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)生及凋亡，活化的受體酪氨酸激酶能夠激活Ras蛋白，發(fā)生蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而傳送到細(xì)胞核，這條通路可以由生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、射線、滲透壓以及體液流過(guò)細(xì)胞表面時(shí)產(chǎn)生的切應(yīng)力等多種因素激活，被稱(chēng)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogenic activated protein kinase，MAPK)通路[11]。MAPK系統(tǒng)還包括ERK、MEK及Raf 3種因子，Raf是MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第1個(gè)分子，它的活化可引發(fā)蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而MEK可以使位于其下游的蘇氨酸和酪氨酸殘基磷酸化而激活，即Raf作用于MEK，使之磷酸化而活化，活化的MEK再作用于屬于MAPK家族的ERK，使其磷酸化而活化，從而介導(dǎo)炎癥及惡性細(xì)胞增殖[12]。且已有研究報(bào)道顯示，肝癌患者Raf 及其下游基因 MEK、ERK 的表達(dá)均上調(diào)，Raf存在過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，肝癌患者Raf水平明顯高于正常人的表達(dá)水平[13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 異槲皮苷對(duì)HepG2細(xì)胞的具有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)。異槲皮苷作用HepG2細(xì)胞48 h后, 倒置顯微鏡下觀察到HepG2的典型凋亡細(xì)胞，且隨著藥物濃度的增加，被阻滯在G1期的細(xì)胞百分比值逐漸增大。RT-PCR 和 Western blot 實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組相比，異槲皮苷能夠明顯降低ERK、MEK、Raf、Ras mRNA表達(dá)，并使ERK1、p-ERK1、p-MEK、Raf、p-Raf 及Ras蛋白表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示異槲皮苷治療肝癌的機(jī)制與誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡有關(guān)，其中，通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)Ras、Raf、MEK、ERK mRNA及相關(guān)蛋白的表達(dá)可能是異槲皮苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)顯示異槲皮苷具有較好的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，在治療肝癌方面具有較好的應(yīng)用前景。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝臟疾病研究室完成。)

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TheinhibitoryeffectofisoquercitrinonRaf/MEK/ERKsignalingpathwayinHepG2cells

JIANG Guo-jun1, LIU Tian-xu1, HUANG Gui-hong2, WU Ting1, TAO Li-qun2, ZHU Zhao-ming2

(1.LinguiClinicalCollege,GuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541199,China;2.DeptofPharmacy,theSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541199,China)

AimTo study the inhibitory effect of isoquercitrin on Raf/MEK/ERK signaling pathway in HepG2 cells.MethodsMTT was used to detect the proliferation of human liver cancer HepG2 cells after the treatment of isoquercitrin. The morphology and growth of cells were observed under inverted microscope after the different concentrations of isoquercitrin(0, 40, 80, 160, 320 μmol·L-1) to treat HepG2 cells for 24 and 48 h. Cell cycle was assessed by flow cytometry. Ras, Raf, MEK, ERK expression was assayed by Western blot, and mRNA expression was detected by quantitative fluorescence PCR.ResultsIsoquercitrin could inhibit the growth of HepG2 cells in a concentration-and time-dependent manner. Typical morphological changes of apoptosis were observed by inverted microscopy after HepG2 cells were treated with different concentrations of of isoquercitrin for 24 h or 48 h. The cell cycle assay showed that with the increasing concentration of isoquerditrin, the number of cells that was arrested in G1phase gradually increased. Compared with the blank group, the expressions of Ras, Raf, MEK, ERK mRNA were down-regulated, and related proteins expression were also down-regulated(P<0.05), and these results had statistical significance.ConclusionIsoquercitrin can induce the apoptosis of HepG2 cells, which may be related to the Raf/MEK/ERK signaling pathway.

isoquercitrin; induce; HepG2 cells; Raf/MEK/ERK; signaling pathway; apoptosis

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.011

A

：1001-1978(2017)10-1382-06

R284.1；R329.24；R329.25；R735.702.2

時(shí)間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.022.html

2017-05-29,

2017-07-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81260661)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2012GXNSFAA053079)；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目面上項(xiàng)目(No 20140120-1-9;No 20170109-47)；廣西肝損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室子課題資助項(xiàng)目(No 15-140-46-14)

蔣國(guó)君(1990-)，女，碩士生，研究方向：臨床藥學(xué)與應(yīng)用，E-mail：784684807@qq.com； 黃桂紅(1972-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病及哮喘藥物，通訊作者，E-mail：huangguihong120@126.com