于慶龍，張 瑩，王宏健，金 愛，宛 蕾，王旭東

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室、2. 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025)

17β-雌二醇對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響及CANP-FN通路的介導(dǎo)作用

于慶龍1，張 瑩1，王宏健1，金 愛1，宛 蕾2，王旭東1

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室、2. 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025)

目的探討17β-雌二醇(E2)對人乳腺癌細(xì)胞遷移活動的影響及其信號機制。方法以雌激素受體(ER)陽性MCF-7和ER陰性MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞為研究模型，E2處理誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。采用劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力，小分子RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞沉默纖連蛋白(FN)基因表達(dá)，Western blot法檢測蛋白水平，鈣蛋白酶(CANP)特異性抑制劑Calpeptin(Cal)預(yù)處理細(xì)胞干預(yù)胞內(nèi)CANP活性。結(jié)果① E2(50 nmol·L-1)處理24 h可明顯促進(jìn)MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞遷移，遷移率分別增加(51.55±5.50)%(P<0.05)和(40.78±4.78)%(P<0.01)；② E2明顯上調(diào)MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞FN蛋白表達(dá)水平，分別為對照組的2.11倍(P<0.05)和1.86倍(P<0.01)；③ Cal(10 μmol·L-1)可明顯抑制E2誘導(dǎo)的MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞遷移，抑制率分別為(49.55±6.44)%(P<0.05)和(36.85±4.40)%(P<0.01)；④ Cal能明顯抑制MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞FN蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制率分別為(80.12±4.55)%和(78.84±5.70)%(P<0.01)；⑤ siRNA沉默F(xiàn)N能抑制E2誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞遷移，抑制率分別為(40.65±5.80)%(P<0.01)和(40.88±6.02)%(P<0.05)。結(jié)論E2可促進(jìn)ER陽性或陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移，而CANP-FN信號通路可能參與介導(dǎo)E2的促細(xì)胞遷移效應(yīng)。

17β-雌二醇；鈣蛋白酶；纖連蛋白；細(xì)胞遷移；乳腺癌；雌激素受體

眾所周知，惡性腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因，腫瘤轉(zhuǎn)移包括腫瘤細(xì)胞的脫落、遷移、黏附、侵襲、血管生成等[1-3]。17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)是女性體內(nèi)的重要性激素，在生理情況下，E2對女性生殖系統(tǒng)和乳腺的生長發(fā)育及功能調(diào)節(jié)產(chǎn)生重要影響；病理狀態(tài)下，E2參與誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為[4]。鈣激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP或Calpain)是一種鈣離子依賴性胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶。通過有限蛋白水解(多在肽鏈N端)底物蛋白，對蛋白產(chǎn)生翻譯后修飾作用，從而調(diào)節(jié)底物蛋白的活性或穩(wěn)定性。新近資料顯示，E2促進(jìn)乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲可能受胞內(nèi)CANP影響，高活性CANP與乳腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)[5-7]。纖連蛋白(fibronectin, FN)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，F(xiàn)N上調(diào)與多種癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲活動有關(guān)[8-9]。然而，E2促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移是否與CANP-FN信號通路有關(guān)，目前尚未見文獻(xiàn)報道。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7(ER陽性)和MDA-MB-468 (ER陰性)，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素，購自Hyclone公司；L15培養(yǎng)基(Leibovitz′s L-15)，購自北京索萊寶公司；胎牛血清(FBS)，Gibco公司；活性炭處理胎牛血清(charcoal-stripped fetal bovine serum，CS-FBS)，四季青公司；siRNA序列設(shè)計、合成及轉(zhuǎn)染試劑，上海吉瑪公司；17β-雌二醇(E2)，Sigma Aldrich公司；FN抗體、CANP2抗體、羊抗小鼠IgG-HRP 抗體，Santa Cruz公司；GAPDH 抗體，Bioworld公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM(高糖，含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)中。MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)在L15(高糖，含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)中。模型細(xì)胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2E2處理 細(xì)胞在有酚紅完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至60%融合后，換成加2.5% CS-FBS的無酚紅DMEM培養(yǎng)24 h，再以無血清、無酚紅DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后按實驗要求加入一定劑量的E2處理24 h。

1.2.3劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞接種于12孔板中，有酚紅條件下培養(yǎng)至90%～100%融合后，無菌條件下用200 μL槍頭在培養(yǎng)皿底作輕柔十字劃痕，形成單細(xì)胞層無細(xì)胞區(qū)(寬約1.5 mm)，然后以PBS清洗2～3次，以除去漂浮細(xì)胞。根據(jù)實驗要求，更換有酚紅或無酚紅培養(yǎng)基(含1.5% CS- FBS)繼續(xù)培養(yǎng)，按實驗要求加入藥物處理。于倒置顯微鏡下，分別在0、24 h時間點照相，觀察和分析對照組和處理組劃痕寬度的變化。各組24 h細(xì)胞遷移距離=0 h劃痕寬度- 24 h劃痕寬度；設(shè)定對照組遷移率為100%。處理組24 h細(xì)胞遷移率/%=24 h處理組細(xì)胞遷移距離/24 h對照組細(xì)胞遷移距離×100%。

1.2.4siRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，用0.5 mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM或L15細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞接種在24孔板上。選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24 h內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70%～90%。轉(zhuǎn)染前，換成無抗生素、無血清的培養(yǎng)基。siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為40 pmol，準(zhǔn)備siRNA-lipo2000混和液，稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(lipo2000)，使用前，將lipo2000試劑搖勻，然后取適量，用不含血清的培養(yǎng)基稀釋，輕輕混和，室溫孵育5 min；用不含血清的培養(yǎng)基稀釋siRNA，加入量為40 pmol，輕輕混和；稀釋好的lipo2000經(jīng)過5 min的孵育后，與稀釋好的siRNA輕輕混和，室溫20 min以形成siRNA-lipo2000混和物。將siRNA-lipo2000混和液加入含有細(xì)胞以及培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕搖晃，使之混和。將培養(yǎng)板置于37°C的CO2培養(yǎng)箱中至檢測時間24 h。

1.2.5蛋白印跡檢測 細(xì)胞培養(yǎng)融合至70%，按實驗要求處理細(xì)胞后，加入RIPA細(xì)胞裂解液(使用前20 min加蛋白酶抑制劑，使其終濃度為1 mmol·L-1)，在冰上溫育15 min以充分裂解，然后在4℃、20 627×g離心15 min。取樣品上清液留用，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行Western blot檢測時，每個泳道按30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(美國Millipore公司)上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入FN抗體(1 ∶500)或抗Calpain2(1 ∶2 000)室溫雜交1～2 h或4℃孵育過夜。一抗處理后，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1 ∶2 000)，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)進(jìn)行顯色，Syngene Imaging System進(jìn)行成像，以Quantity One對蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果

2.1E2增強MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的遷移能力以E2(50 nmol·L-1)刺激細(xì)胞24 h，能明顯增加MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的遷移能力(Fig 1A)。與對照組相比，E2處理組MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞遷移率分別增加(51.55±5.50)%和(40.78±4.78)%(Fig 1B)。

Fig 1 E2 treatment stimulated migration in breast cancer cells

A：Treatment of MCF-7 and MDA-MB-468 cells with E2 increased cell migration；B：Migration rate of MCF-7 and MDA-MB-468 breast cancer cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2E2對乳腺癌細(xì)胞FN蛋白表達(dá)的影響E2能夠明顯上調(diào)MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞FN蛋白的表達(dá)，相對于對照組分別上調(diào)2.11和1.86倍(Fig 2)。

2.3Calpeptin抑制E2誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移以CANP抑制劑Calpeptin(Cal 10 μmol·L-1)預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移受到明顯抑制(Fig 3A)，在MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞，抑制率分別達(dá)到(49.55±6.44)%和(36.85±4.40)%(Fig 3B)。

Fig 2 Effect of E2 treatment onexpressionof FN in breast cancer cells

A:Treatment of MCF-7 and MDA-MB-468 cells with E2 enhanced the expression of FN；B: Relative protein expression of FN in MCF-7 and MDA-MB-468 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.4Calpeptin抑制E2誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞FN上調(diào)Cal(10 μmol·L-1)預(yù)處理可有效抑制E2誘導(dǎo)的MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞FN蛋白上調(diào)，其抑制率分別為(80.12±4.55)%和(78.84±5.70)%(Fig 4)。

2.5FN-siRNA轉(zhuǎn)染抑制E2誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移在MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞中，特異性轉(zhuǎn)染FN(FN-siRNA)能有效地抑制E2誘導(dǎo)的FN蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制率分別為(83.45±3.30)%和(80.15±4.04)%(Fig 5A)。同時給予E2，F(xiàn)N-siRNA組乳腺癌細(xì)胞遷移率較空載對照(NCSI)組細(xì)胞降低。轉(zhuǎn)染FN-siRNA后，MCF-7乳腺癌細(xì)胞遷移率降低(40.65±5.80)%，MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞遷移率降低(40.88±6.02)%(Fig 5B)。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近幾十年來，人類在乳腺癌的早期診斷和治療方法方面已取得較大進(jìn)步，但乳腺癌死亡率并沒有明顯下降，同時乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)快速增高趨勢[10]。防治乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是提高患者存活率及改善生活質(zhì)量的關(guān)鍵，因而對乳腺癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞分子機制進(jìn)行深入研究具有重要的臨床指導(dǎo)意義。業(yè)已證明，E2是促進(jìn)乳腺癌惡性演進(jìn)的重要因素之一，但其作用機制尚未完全明了。研究顯示，下調(diào)或抑制CANP可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，如HER2(+)(SKBR3)和三陰性乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)[11]；Bugide 等[12]的研究中，CANP2被發(fā)現(xiàn)在MAPK的介導(dǎo)下可以調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移及黏附，提示CANP與包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的惡性演進(jìn)有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，E2可上調(diào)并激活CANP，從而影響MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖活動[13]。本研究結(jié)果顯示，在MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞，E2處理可明顯上調(diào)FN蛋白表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞遷移，而CANP抑制劑Calpeptin能明顯抑制E2誘導(dǎo)模型細(xì)胞FN表達(dá)及細(xì)胞遷移，提示CANP及FN可能與E2增強乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。

Fig 3 Effect of Calpeptin on migration induced by E2 in breast cancer cells

A：Pretreatment with calpeptin decreased E2-induced cell migration；B：Migration rate of MCF-7 and MDA-MB-468 breast cancer cells.**P<0.01vsE2

Fig 4 Effect of Calpeptin on FN Protein induced by E2

A: Calpeptin pretreatment inhibited E2-induced fibronectin upregulation; B: Relative protein expression of FN in MCF-7 and MDA-MB-468 cells.*P<0.05,**P<0.01vsE2

為了進(jìn)一步探明FN在E2-CANP信號通路中的作用，本研究采用siRNA沉默F(xiàn)N基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)N可使E2誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移效應(yīng)受到明顯抑制。本課題組曾報道，E2可通過CANP-周期蛋白E/FAK通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[13-14]。有研究顯示，E2可誘導(dǎo)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)乳腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移侵襲行為[8-9,15]。這些提示我們，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)FN的表達(dá)可能受周期蛋白E或FAK蛋白調(diào)控；CANP及其下游信號通路或參與細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究顯示，無論是ER陽性或陰性乳腺癌細(xì)胞，E2均可誘導(dǎo)FN蛋白上調(diào)，而此效應(yīng)依賴于CANP，且抑制CANP活性可逆轉(zhuǎn)E2誘導(dǎo)的FN上調(diào)。同時，F(xiàn)N基因沉默可明顯抑制E2誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移活動。這些結(jié)果提示，CANP-FN信號通路參與介導(dǎo)E2誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移效應(yīng)，干預(yù)胞內(nèi)CANP-FN信號通路可能有助于遏制E2的促癌作用。

Fig 5 Effect of FN on migration of breast cancer cells

A: siRNA FN transfection down-regulated E2-enhanced FN protein expression; B: Transfection of siRNA against FN inhibited cell migration induced by E2.*P<0.05,**P<0.01vsNCSI

(致謝：本實驗在貴州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室所屬實驗室完成，感謝生理學(xué)教研室所有的老師和同學(xué)對本課題研究給予悉心指導(dǎo)和幫助。)

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Roleofcalpain-fibronectinsignalinginestrogen-inducedmigrationinbreastcancercells

YU Qing-long1, ZHANG Ying1,WANG Hong-jian1, JIN Ai1,WAN Lei2, WANG Xu-dong1

(1.DeptofPhysiology; 2.DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

AimTo study the effect of estrogen on the migration of breast cancer cells and the possible underlying mechanisms. Methods Human breast cancer cell lines MCF-7(estrogen receptor, ER+) and MDA-MB-468(ER-) were employed as a model system. Cells were treated with E2 and pretreated with CANP inhibitor(calpeptin)where needed. Wound-healing assay was applied to evaluate cell migration, Western blot assay was performed to observe protein level, and fibronectin expression was silenced by specific siRNA transfection.Results① Treatmentof MCF-7 and MDA-MB-468 cellswith E2(50 nmol·L-1) increased cell migration by(51.55±5.50) %(P<0.01)and (40.78±4.78)%(P<0.05), respectively; ② E2 significantly up-regulated the expression of FN protein in MCF-7 and MDA-MB-468 breast cancer cells, which was 2.11 times(P<0.05)and 1.86 times(P<0.01), respectively;③ Pretreatment with calpeptin(10 μmol·L-1) decreased E2-induced cell migration by (49.55±6.44)%(P<0.05) in MCF-7 and (36.85±4.40)% (P<0.01)in MDA-MB-468 cells;④ Calpeptin pretreatment inhibited E2-induced fibronectin up-regulation by(80.12±4.55)% and(78.84±5.70) %(P<0.01), respectively;⑤ Knockdown of FN with siRNA suppressed cell E2-induced migration by(40.65±5.80)%(P<0.01)in MCF-7 and(40.88±6.02)%(P<0.05)in MDA-MB-468 cells.ConclusionE2 stimulates the migration of breast cancer cells with or without ER expression and a calpain-FN signaling pathway may be involved in the E2 action.

estrogen；calpain；fibronectin；cell migration；breast cancer；estrogen receptor

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.009

A

：1001-1978(2017)10-1371-06

R329.25；R392.11；R737.902.2；R977.3；R977.6；R977.12

時間：2017-9-5 9:25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.018.html

2017-05-14,

2017-07-01

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31660345，31360252)

于慶龍(1990-)，男，碩士生，研究方向：抗腫瘤藥物藥理學(xué)，E-mail:769437638@qq.com； 王旭東(1960-)，男，碩士，教授，研究方向：抗腫瘤藥物藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: 1157102188@qq.com