石洪超　歐慧瑜　何風(fēng)雷

[摘要] 目的 研究舒筋健腰丸對坐骨神經(jīng)痛大鼠的坐骨神經(jīng)組織病理改變以及血清中細胞因子的影響。 方法 選取112只SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組，模型組，壯骨關(guān)節(jié)丸組，芬必得酚咖片組，舒筋健腰丸高（4.38 g/kg）、中（2.19 g/kg）、低（1.10 g/kg）劑量組，每組16只。通過鈍性分離，暴露大鼠右下肢坐骨神經(jīng)并對其進行4道結(jié)扎，制備坐骨神經(jīng)痛模型。假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎坐骨神經(jīng)。造模成功后，連續(xù)灌胃給藥28 d。末次給藥后，檢測各組大鼠的縮爪潛伏期，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的含量及坐骨神經(jīng)組織的病理學(xué)改變。 結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠縮爪潛伏期明顯縮短（P < 0.05），坐骨神經(jīng)發(fā)生水腫和空泡變性，血清中IL-1β、IL-6含量顯著升高（P < 0.05）。與模型組相比，舒筋健腰丸組縮爪潛伏期延長（P < 0.05），坐骨神經(jīng)病的變程度減輕，血清中炎性因子IL-1β、IL-6含量下降（P < 0.05）。 結(jié)論 舒筋健腰丸能明顯減輕坐骨神經(jīng)組織學(xué)改變，抑制炎性因子表達，對損傷性神經(jīng)痛具有治療作用。

[關(guān)鍵詞] 舒筋健腰丸；坐骨神經(jīng)痛；細胞因子；組織病理

[中圖分類號] R96 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（a）-0011-05

[Abstract] Objective To study the effect of Shujin Jianyao Pills on the pathological changes of ischiadic nerve and cytokine in the serum of CCI （chronic constriction injury） rats. Methods 112 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， Zhuanggu Guanjie Pill group， Paracetamol and Caffeine Tablets group， Shujin Jianyao Pill low dose group （1.10 g/kg）， middle dose group （2.19 g/kg） and high dose group （4.38 g/kg）， with 16 rats in each group. The right common sciatic nerve was exposed by blunt dissection， and four ligatures were tied loosely around the sciatic nerve. Sham operation referred to the procedure of exposing the nerve as above but without any nerve ligation. All groups were administrated with corresponding drugs by intragastric administration once a day for 28 days. After the last administration， the hindpaw withdrawal latency （HWL） of the rats， the contents of inflammatory cytokines including TNF-α， IL-1β， IL-6， PGE2 in the serum and the pathological changes of ischiadic nerve were detected. Results Compared to the sham operation group， in the model group， the HWL was shortened， ischiadic nerve was become swollen and vacuolar， the serum levels of IL-1β and IL-6 were increased （P < 0.05）. Compared to the model group， in the Shujin Jianyao Pill groups， the HWL were extended， the pathological changes were ameliorated induced by CCI， and the IL-1β and IL-6 levels were decreased （P < 0.05）. Conclusion Shujin Jianyao Pill can alleviate the histologic changes of sciatic nerve， inhibit the expression of inflammatory cytokines， which has therapeutic effect on traumatic neuralgia.

[Key words] Shujin Jianyao Pill； Sciatica； Cytokine； Histopathology

神經(jīng)病理性疼痛是由外力損傷或疾病侵襲神經(jīng)系統(tǒng)引起的復(fù)雜慢性疼痛。持續(xù)的神經(jīng)痛可影響患者的生理和精神狀態(tài)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)抑郁和焦慮等情緒障礙，嚴(yán)重時可導(dǎo)致患者出現(xiàn)自殺傾向，對社會的危害極其嚴(yán)重[1-2]。迄今為止，神經(jīng)痛的發(fā)病機制仍不清楚，研究神經(jīng)痛的發(fā)病機制和開發(fā)有效的治療方法是目前迫切需要解決的問題。慢性壓迫性坐骨神經(jīng)損傷（CCI）模型能模擬神經(jīng)痛部分臨床癥狀，可用于神經(jīng)痛發(fā)病機制的研究和治療神經(jīng)痛的藥物篩選[3-4]。endprint

目前，針對神經(jīng)痛的治療，仍以非甾體抗炎藥（NSAIDs）、抗抑郁藥或嗎啡類藥物為主，僅對部分患者有效，但是存在副作用大的缺點。中醫(yī)藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，在治療一些慢性復(fù)雜疾病方面具有獨特的優(yōu)勢[5-8]。舒筋健腰丸是陳李濟藥廠的獨家中藥品種，具有補益肝腎，強健筋骨，驅(qū)風(fēng)除濕，活絡(luò)止痛的功效。多年來臨床用于治療坐骨神經(jīng)痛，效果良好。據(jù)報道，舒筋健腰丸具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[9-10]，但是舒筋健腰丸對CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)痛是否具有緩解作用，仍需要進一步的研究。本研究擬建立大鼠CCI神經(jīng)痛模型，采用行為學(xué)、ELISA、HE染色等方法，考察舒筋健腰丸對大鼠神經(jīng)痛的影響，并通過與已上市藥品進行比較，為臨床研究與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

112只SD大鼠（180～220 g），SPF級，雄性，4周齡，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。實驗動物合格證號：SCXK（湘）2013-0004；飼養(yǎng)環(huán)境：每天12 h照明/12 h黑暗交替，溫度（24±2）℃，相對濕度50%～60%，自由攝食和飲水。動物實驗的操作步驟均得到廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 藥品及試劑

舒筋健腰丸粉（批號：16330），廣州白云山陳李濟藥廠有限公司；壯骨關(guān)節(jié)丸（批號：1511003S），華潤三九醫(yī)藥股份有限公司；芬必得酚咖片（批號：16010448），中美天津史克制藥有限公司；戊巴比妥鈉（批號：120505），德國默克公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號：E-EL-R0019c）、白介素-1β（IL-1β，批號：E-EL-R0012c）、白介素-6（IL-6，批號：E-EL-R0015c）、前列腺素E2（PGE2，批號：E-EL-R0034c）ELISA檢測試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3 儀器

Elx800酶標(biāo)儀，美國Bio Tek公司；BX53生物顯微鏡和DP73熒光顯微鏡，CellSens Standard病理圖像分析系統(tǒng)，日本Olympus公司；3-18k高速冷凍離心機，德國Sigma公司；ASP 300全密封自動脫水機，德國Leica公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠CCI模型制備及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將112只SD大鼠按照體重隨機分為假手術(shù)組和造模組，其中假手術(shù)組16只，其余動物皆為造模組，參照文獻[11]描述的方法，制備CCI模型。每只動物均給予2%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）麻醉，麻醉后剃去動物右下肢皮膚的毛，麻醉動物俯臥位固定，碘酒消毒，剪開右下肢皮膚，逐層分離皮下脂肪、淺筋膜，鈍性分離股二頭肌，使坐骨神經(jīng)主干暴露在視野內(nèi)，用玻璃分針挑出坐骨神經(jīng)主干，對其進行4道結(jié)扎（結(jié)扎線采用4-0醫(yī)用羊腸線），每道結(jié)扎的間距約為1 mm（結(jié)扎程度以切口暴露周圍的肌肉產(chǎn)生輕微、短暫的抽搐為準(zhǔn)），用0.9%氯化鈉注射液沖洗切口，結(jié)扎后對肌肉和皮膚逐層進行縫合，縫合前后均在傷口處給予0.2 mL的青霉素鈉注射液，以防感染。假手術(shù)組動物僅暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎，其余操作方法與上述描述相同。造模第7 d對動物進行機械刺激回縮反應(yīng)測定，與造模前相比，出現(xiàn)明顯回縮反應(yīng)的動物即為造模成功的動物，可進行后續(xù)實驗，否則就從整體實驗中剔除。所有模型大鼠動物均造模成功，將模型大鼠隨機分為模型組（0.5% CMC-Na溶液），壯骨關(guān)節(jié)丸組，芬必得酚咖片組，舒筋健腰丸高、中、低劑量組，每組16只。造模第8 天開始對各組動物進行灌胃給藥，除芬必得酚咖片組動物連續(xù)給藥5 d，間隔2 d給藥1次外，余下各組動物均每天1次，連續(xù)給藥28 d（各組動物的給藥體積均為10 mL/kg）。

1.4.2 熱痛覺過敏測定 將大鼠放入輻射熱刺痛儀的有機玻璃格子中，安靜環(huán)境中適應(yīng)20 min后，用強光照射大鼠腳掌中部皮膚，測定大鼠的縮爪潛伏期，每隔10 min測1次，取3次測定結(jié)果的平均值作為測定結(jié)果。為防止大鼠腳底被熱輻射燙傷，將潛伏期的上限值定為30 s。

1.4.3 標(biāo)本采集與病理檢查 用20%烏來糖皮下注射麻醉，采用腹主動脈采血5 mL，3000 r/min離心15 min取上層血清，-20℃保存待測。坐骨神經(jīng)標(biāo)本的處理：每組選取8只，于大鼠造模側(cè)損傷部位神經(jīng)取兩段組織，分別為結(jié)扎區(qū)域及距離結(jié)扎區(qū)域2.5～3.0 cm的結(jié)扎神經(jīng)，放入10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋制片及HE染色封片，光鏡檢查。組織學(xué)改變程度用-、+、++、+++表示正常、輕度、中度和重度。水腫發(fā)生率=出現(xiàn)水腫例數(shù)/總動物數(shù)×100%，空泡變性發(fā)生率=出現(xiàn)空泡變性例數(shù)/總動物數(shù)×100%。

1.4.4 細胞因子的檢測 采用ELISA 試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作，檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，等級資料比較采用秩和檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舒筋健腰丸對CCI模型大鼠縮爪潛伏期的影響

與假手術(shù)組相比，模型組動物的縮爪潛伏期顯著縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與模型組相比，舒筋健腰丸高、中、低劑量組可以顯著延長模型大鼠的縮爪潛伏期，而且高劑量組的效果優(yōu)于中劑量組和低劑量組（P < 0.05）。見表1。

2.2 舒筋健腰丸對CCI模型大鼠坐骨神經(jīng)組織病理改變的影響

假手術(shù)組動物坐骨神經(jīng)周圍間質(zhì)及神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，未見異常變化；與假手術(shù)組相比，模型組動物均可見細胞質(zhì)內(nèi)可見多數(shù)空泡，細胞核排列不規(guī)則，并可見許多肥大細胞，為坐骨神經(jīng)空泡變性（圖1）。與模型組比較，壯骨關(guān)節(jié)丸組、芬必得酚咖片組、舒筋健腰丸高劑量組、中劑量組、低劑量組坐骨神經(jīng)水腫、空泡變性程度降低（P < 0.05）。見表2。endprint

2.3 舒筋健腰丸對CCI模型大鼠血清炎性因子的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組動物血清中IL-lβ、IL-6、TNF-α和PGE2含量顯著升高（P < 0.05）；與模型組比較，壯骨關(guān)節(jié)丸組、芬必得酚咖片組、舒筋健腰丸高、中劑量組IL-lβ和IL-6含量均有不同程度的下降（P < 0.05）；TNF-α、PGE2差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。其中，舒筋健腰丸高劑量組IL-lβ和IL-6含量低于中低劑量組（P < 0.05）。

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是一種臨床常見的慢性疼痛，其在人群中的發(fā)病率約為7%，中國約有1600萬例神經(jīng)病理性疼痛患者?；颊叱０橛幸钟?、焦慮和睡眠障礙等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也給患者的家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)[12-13]。因此，尋找治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物受到越來越多的關(guān)注。CCI是一種周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)痛的經(jīng)典模型，與其他模型相比，具有顯著的痛覺過敏現(xiàn)象，癥狀可持續(xù)8周以上[14]。本研究選用CCI大鼠模型來研究舒筋健腰丸對神經(jīng)痛的作用。結(jié)果顯示，在熱痛覺過敏測定中，舒筋健腰丸可延長CCI模型大鼠的縮爪潛伏期，改善大鼠的痛覺過敏行為，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

周圍神經(jīng)損傷后，傷害性刺激從外周傳入中樞，膠質(zhì)細胞上的危險相關(guān)分子模式感知這些信息后會引起膠質(zhì)細胞激活并釋放大量的促炎性細胞因子如IL-lβ和TNF-α等，導(dǎo)致脊髓內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng)[15-16]；神經(jīng)炎性反應(yīng)使傳遞痛覺的神經(jīng)元興奮，促進中樞敏化形成，在行為上則表現(xiàn)為痛覺過敏等現(xiàn)象[17-18]。外源性給予IL-lβ可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)明顯的熱痛過敏[19]，而阻斷中樞的IL-lβ信號可以緩解周圍神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)痛[20]。因此，神經(jīng)炎性反應(yīng)在神經(jīng)病理性痛的形成中起著關(guān)鍵作用。在本研究中，模型組與假手術(shù)組相比，血清內(nèi)IL-lβ、IL-6、TNF-α和PGE2水平明顯升高（P < 0.05）。而與模型組相比，給予舒筋健腰丸28 d可以顯著降低模型大鼠血清內(nèi)IL-lβ和IL-6水平（P < 0.05），雖也能降低TNF -α和PGE2的水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。對大鼠坐骨神經(jīng)組織的病理學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)，連續(xù)28 d給予舒筋健腰丸可減輕CCI引起的神經(jīng)水腫和空泡變性等現(xiàn)象，從而發(fā)揮保護坐骨神經(jīng)的作用。

綜上所述，舒筋健腰丸能明顯緩解CCI模型大鼠坐骨神經(jīng)組織的病理變化，降低血清內(nèi)炎性因子的含量，從而改善模型大鼠的熱痛過敏行為。提示舒筋健腰丸對坐骨神經(jīng)痛具有明確的治療作用。在后續(xù)的實驗中，將進一步研究其具體的作用靶點，為舒筋健腰丸臨床的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-04-28 本文編輯：李岳澤）endprint