李華萍+孫圣榮+陳創(chuàng)+汪媛

[摘要] 目的 研究多聚蛋白-2（MMRN2）在乳腺癌中的表達(dá)及對預(yù)后的影響，探討其在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法 收集2013年1月～2017年4月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院行手術(shù)切除的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本和癌旁組織50例，采用Western blot和qRT-PCR檢測MMRN2的表達(dá)情況，分析MMRN2表達(dá)量高低與患者病理特征及預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 MMRN2在乳腺癌組織中低表達(dá)（P < 0.01），MMRN2表達(dá)量高低與患者病理特征無明顯相關(guān)性（P > 0.05），MMRN2高表達(dá)可以延長乳腺癌患者總生存期（P=0.036）和無復(fù)發(fā)生存期（P=0.019）。 結(jié)論 MMRN2是乳腺癌的抑癌基因，可以作為一個(gè)潛在的乳腺癌分子治療靶點(diǎn)，提高患者生存期。

[關(guān)鍵詞] 多聚蛋白-2；乳腺癌；抑癌基因；預(yù)后

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（b）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of MMRN2 in breast cancer and its influence on prognosis， discuss the mechanism of MMRN2 in breast cancer. Methods Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression of MMRN2 in 50 pairs of human breast invasive ductal carcinoma specimens and adjacent tissues， which had excision by surgery in Renmin Hospital of Wuhan University from January 2013 to April 2017. The relationship between the expression of MMRN2 and the pathologic features and prognosis of patients were analyzed. Results The expression of MMRN2 in breast cancer was down-regulated （P < 0.01）， and the expression of MMRN2 was not correlated with the pathological characteristics of patients （P > 0.05）. Up-regulated MMRN2 could prolong the overall survival （P = 0.036） and no recurrence survival time （P = 0.019） of patients with breast cancer. Conclusion MMRN2 is a tumor suppressor gene for breast cancer， and can serve as a potential target for molecular treatment of breast cancer， improve patients′ survival.

[Key words] MMRN2； Breast cancer； Anti-oncogene； Prognosis

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康與生命最常見的惡性腫瘤之一，其中乳腺浸潤性導(dǎo)管癌多發(fā)[1]。近年來我國乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢。全球最新數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌致死率在女性惡性腫瘤中排位第2位[2]。乳腺癌是一種異質(zhì)性腫瘤，在分子表型、生物學(xué)、治療敏感性等方面存在著多樣性[3]。盡管雌激素受體內(nèi)分泌治療在乳腺癌臨床控制中發(fā)揮著重要作用，然而內(nèi)分泌治療耐藥和三陰性乳腺癌的問題大大減弱了其治療效果[4]。因此，尋求新的靶點(diǎn)，用分子生物學(xué)方法治療乳腺癌是目前研究的熱點(diǎn)。本研究分析了乳腺癌患者多聚蛋白-2（multimerin2，MMRN2）的表達(dá)情況，并觀察其與病理特征的關(guān)系，為分子靶向治療乳癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選擇2013年1月～2017年4月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院普外科行手術(shù)切除的乳癌組織標(biāo)本50例，并取同一病例的癌旁組織（距離癌組織>2 cm的乳腺組織）。術(shù)前患者均未接受任何放化療、內(nèi)分泌治療，術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)為浸潤性導(dǎo)管癌?；颊呔鶠榕裕刹±韺W(xué)家根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行乳腺癌分級。標(biāo)本的獲取經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，研究嚴(yán)格按照道德規(guī)范進(jìn)行設(shè)計(jì)和實(shí)施，參與者均簽署知情同意書。所有標(biāo)本獲取后用生理鹽水去除血漬，裝入凍存管后迅速保存于液氮中。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

取黃豆大小的組織標(biāo)本液氮研磨至粉末狀，裝入1.5 mL離心管，加入1 mL Trizol置于室溫下裂解15 min，然后加入200 mL氯仿劇烈震蕩后冰上靜置10 min，4℃ 12000 r/min離心15 min。吸取上清液裝入干凈離心管中并加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20℃靜置20 min。4℃ 12000 r/min離心15 min棄上清液，配置75%乙醇溶液洗滌沉淀物2遍，用無RNA酶超純水溶解。使用Nandrop分光光度計(jì)（Thermo，美國）測量RNA濃度和純度。采用高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（QPK-201，日本）將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，置于-20℃保存。按照Takara qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測各基因的表達(dá)量。按95℃ 10 min，90℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，7500 Fast System SDS軟件（BIO-RAD，美國）分析Ct值，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT計(jì)算方法。引物序列由武漢巴菲爾生物有限公司設(shè)計(jì)合成，詳見表1。endprint

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)

采用液氮碾磨法將乳腺癌組織磨至粉末狀，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液置于冰上充分裂解細(xì)胞15 min，4℃ 12000 r/min離心5 min，獲取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，按照1∶1的比例加適量的上樣緩沖液（loading buffer），沸水浴煮10 min使蛋白變性，置于-80℃保存。制備SDS-PAGE凝膠，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算出上樣體積，加樣。60 mA恒流電泳約1 h，轉(zhuǎn)膜，封閉，MMRN2一抗過夜孵育（Abbexa，北京），二抗（生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 1∶10000）孵育，漂洗，經(jīng)ECL試劑盒（BestBio，上海）顯色，凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）掃描處理。

1.4 生物信息學(xué)

運(yùn)用Blast軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）設(shè)計(jì)MMRN2的引物。采用Kaplan-Meier plotter軟件（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=breast）預(yù)測MMRN2表達(dá)高低與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有圖表運(yùn)用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，CA，USA）制作。采用IBM SPSS 20.0（IBM，USA）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中MMRN2 mRNA水平

測定50例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和對應(yīng)癌旁組織中MMRN2的表達(dá)量。結(jié)果表明，MMRN2 mRNA在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本中表達(dá)量明顯低于癌旁組織（P < 0.01）。見圖1。另外，分析MMRN2的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系顯示，MMRN2表達(dá)量高低與患者年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級無顯著相關(guān)性（P > 0.05）。見表2。

2.2 乳腺癌組織中MMRN2蛋白水平

運(yùn)用Western blot檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和對應(yīng)癌旁組織總蛋白中MMRN2的表達(dá)量，結(jié)果表明：乳腺癌組織中MMRN2的蛋白表達(dá)量明顯低于癌旁組織（P < 0.05），提示MMRN2在乳腺癌中低表達(dá)。見圖2。

2.3 MMRN2表達(dá)高低與患者預(yù)后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier plotter軟件預(yù)測MMRN2表達(dá)高低與616例患者總生存期（overall survival，OS）和1764例患者無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）的情況。結(jié)果提示：MMRN2高表達(dá)的OS（logrank P=0.036）和RFS（logrank P=0.019）均高于MMRN2低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

3 討論

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，不同的亞型具有不同的分子生物學(xué)和臨床過程。標(biāo)準(zhǔn)臨床和病理特征的評估傳統(tǒng)上用于確定在乳腺癌患者中是否使用輔助全身治療[6]。然而，通過識別特征，讓患者從輔助化療中受益仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，可能導(dǎo)致一些患者過度治療。分子醫(yī)學(xué)的進(jìn)步大大提高了乳腺腫瘤基因表達(dá)譜的準(zhǔn)確性，從而改善了預(yù)測患者乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的準(zhǔn)確性和對內(nèi)分泌治療和/或化學(xué)療法的可能反應(yīng)能力[7-9]?；蚪M測定可輔助醫(yī)生在個(gè)體水平上為患者制訂個(gè)性化治療方案。目前通過檢測乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)的基因，開發(fā)基因治療法，可直接或間接通過刺激抗腫瘤免疫行特異性靶向癌細(xì)胞治療。

MMRN2是與細(xì)胞表面緊密相關(guān)的ECM糖蛋白，包含p125、p140、p110和p200 4個(gè)不同的二硫鍵合亞基，具有信號肽、N末端EMI結(jié)構(gòu)域和由中心卷曲螺旋富含區(qū)域分離的C末端C1q結(jié)構(gòu)域的EMILIN樣蛋白[10]。MMRN2在正常和腫瘤血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，是某些腫瘤中新血管形成的研究熱點(diǎn)[11]。MMRN2特別保存在內(nèi)皮細(xì)胞中，與血管緊密排列，并且存在于血管的腔側(cè)[12]。然而，直到最近，MMRN2在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞中的功能仍然難以捉摸[13]。Lorenzon等[11]最近發(fā)現(xiàn)了MMRN2的抗血管生成作用，它抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管組織而不影響增殖。MMRN2劑量依賴性地?fù)p害了成纖維細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中微血管的形成，并大大減少了大鼠主動(dòng)脈環(huán)的血管發(fā)芽[14]。在體內(nèi)，MMRN2在鈣調(diào)素測定中抑制含血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）海綿體的血管生成發(fā)芽，但不抑制含有b-FGF的海綿70。實(shí)際上，MMRN2被發(fā)現(xiàn)直接結(jié)合VEGF-A，并干擾內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGF/VEGFR2信號傳導(dǎo)[15-16]。MMRN2取代了與HUVEC細(xì)胞結(jié)合的放射性標(biāo)記VEGF，表明蛋白質(zhì)干擾VEGF-VEGFR結(jié)合[12，17]。與MMRN2與內(nèi)皮細(xì)胞表面密切相關(guān)的事實(shí)一致，MMRN2的細(xì)胞周期蛋白濃度很可能是富集的，并且是VEGF結(jié)合VEGFR2隔離和調(diào)節(jié)VEGF活性的重要競爭者。HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞中MMRN2的穩(wěn)定過表達(dá)通過抑制腫瘤血管生成顯著抑制裸鼠異種移植腫瘤生長[18]。直接腫瘤內(nèi)注射重組MMRN2腺病毒也導(dǎo)致腫瘤抑制和抗血管生成作用，但程度較低。MMRN2作為一種血管生成抑制劑有幾個(gè)關(guān)鍵特征：首先，雖然MMRN2表現(xiàn)出泛內(nèi)皮表達(dá)，但似乎并不影響正常的內(nèi)皮細(xì)胞生長、增殖或凋亡。其次，MMRN2具有獨(dú)特的VEGF隔離機(jī)制，這種分子可以用來限制局部血管發(fā)生，以保持靜止?fàn)顟B(tài)，或在病理狀態(tài)下作為VEGF信號的反饋調(diào)節(jié)劑。實(shí)際上，大多數(shù)ECM成員隔離VEGF也影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖[19-20]，但MMRN2表現(xiàn)出獨(dú)特的抑制作用，僅限于內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。最后，MMRN2對腫瘤生長和血管生成的影響開啟了將MMRN2開發(fā)成用于癌癥治療的新抗血管生成藥物的可能性。endprint

本文研究發(fā)現(xiàn)，MMRN2在乳腺癌中顯著低表達(dá)，且高表達(dá)患者預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)者，證明了MMRN2是乳腺癌的抑癌基因。可見，MMRN2可能參與了乳癌的浸潤與轉(zhuǎn)移。今后應(yīng)行體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示乳癌發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找預(yù)測轉(zhuǎn)移指標(biāo)，為指導(dǎo)臨床靶向治療乳癌提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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