馬金魁

李 珂2

韋炳墩1

姚紫婷1

黃曉辰3

(1. 肇慶學院化學化工學院，廣東 肇慶 526061；2. 湖南農業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；3. 肇慶學院生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

百香果籽油超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性

馬金魁1

李 珂2

韋炳墩1

姚紫婷1

黃曉辰3

(1. 肇慶學院化學化工學院，廣東 肇慶 526061；2. 湖南農業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；3. 肇慶學院生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

以百香果為原料，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面分析，優(yōu)化超臨界CO2萃取百香果籽油的工藝，并對百香果籽油的體外抗氧化活性進行研究。結果表明，超臨界CO2萃取百香果籽油的最佳工藝為萃取溫度53.1 ℃，萃取壓力33.9 MPa，萃取時間3.6 h，百香果籽出油率值為26.95%，所得百香果籽油具有較好的還原力，且呈量效關系，對DPPH·的清除能力達80%。超臨界CO2萃取百香果籽油工藝穩(wěn)定可行，提取的百香果籽油具有抗氧化活性，是一種潛在可用的天然抗氧化資源。

百香果；籽油；超臨界CO2萃??；抗氧化性

百香果(PassifloraedulisSims)又名西番蓮、雞蛋果，是一種源自南美洲的多年生長青藤本類雙子葉植物。中國于20世紀初引種栽培，現(xiàn)廣泛栽植于南方熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。百香果果瓤汁多，香味濃郁，富含多種植物蛋白、多糖、維生素、氨基酸和微量元素，具有極高的營養(yǎng)價值[2]。每顆百香果包含種籽約160粒，約占果重10%，含油量可達28.2%，籽仁含油率超過60%。其中不飽和脂肪酸含量高達80%以上，可以幫助人體清除游離的自由基，延緩自然衰老，輔助多種維生素的吸收。

目前，隨著國際市場對百香果果汁需求份額的增大，一些熱帶、亞熱帶栽植地區(qū)掀起了種植百香果的高潮。但大部分百香果籽仍是果汁加工產業(yè)的廢棄物，僅少部分被加工為動物飼料的添加物。迄今為止，對百香果籽油營養(yǎng)價值、生理活性和潛在應用價值的研究也較少，許曉靜等[3]利用索氏提取獲得百香果籽油，并對其理化性質及抗氧化活性進行研究；程謙偉等[4]研究了利用響應面優(yōu)化超聲輔助提取百香果籽油的工藝參數(shù)；何冬梅等[5]用水蒸氣蒸餾法和索氏法提取百香果籽揮發(fā)油，并利用GC-MS對所得揮發(fā)油的成分進行分析。

超臨界CO2萃取是利用CO2在超臨界狀態(tài)下強大的溶解能力和在非超臨界狀態(tài)下低溶解能力的特性，實現(xiàn)對目標物質的分離和提取[6]。與其他萃取方法相比，超臨界CO2萃取技術傳質速率快、提取率高，操作條件溫和、無氧，可減少萃取過程中不飽和脂肪酸的氧化，且萃取后處理簡單，無有機溶劑殘留[7]，在油脂萃取領域有諸多研究報道[8-9]。本研究擬采用超臨界CO2萃取技術提取百香果籽油，以提取率為指標，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面分析對影響萃取工藝的主要參數(shù)進行優(yōu)化，建立超臨界CO2萃取百香果籽油的數(shù)學模型，優(yōu)選出最佳工藝條件，并對提取所得籽油進行體外抗氧化活性分析，以期為百香果籽潛在價值的充分利用和開發(fā)提供有效的研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果籽：挑選市售新鮮紫色百香果，取其籽粒，清除表面雜質，置于通風處過夜晾干。將陰干的百香果籽放入熱風干燥箱中105 ℃干燥至恒重，放入中藥粉碎機粉碎，得均勻的百香果籽粉末；

CO2氣體：純度>99.9%，廣州市廣氣氣體有限公司；

VC：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)：分析純，美國Sigma公司；

其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

離心機：TDL-40B型，上海安亭科學儀器廠；

中藥粉碎機：DFY-600C型，溫嶺林大機械有限公司；

電熱鼓風干燥箱：DHG-9055A型，上海一恒科學儀器有限公司；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海一恒科學儀器有限公司；

分光光度計，V-1100D型，上海美普達儀器有限公司；

超臨界CO2萃取儀：1L-SFE型，廣州美晨高新分離技術有限公司；

電子天平：BSA124S-CW型，賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 百香果籽油超臨界CO2提取工藝流程

百香果籽→烘干→破碎→過篩→稱量→裝入萃取器→設定CO2流量→控制萃取條件(壓力、溫度、時間等)→超臨界CO2萃取→分離→百香果籽油

1.3.2 百香果籽油萃取率 按式(1)計算。

(1)

式中：

E——萃取率，%；

m1——萃取百香果籽油質量，g；

m2——樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗設計 分別以萃取溫度、萃取壓力、萃取時間為變量，以籽油提取率為評價指標，進行單因素試驗，確定各影響因素的適宜范圍。

(1) 萃取溫度對籽油提取率的影響：在萃取壓30 MPa條件下，分別在30，40，50，60，70 ℃萃取3.0 h，考察溫度對籽油提取率的影響。

(2) 萃取壓力對籽油提取率的影響：選取萃取溫度50 ℃，分別在20，25，30，35，40 MPa萃取3.0 h，考察壓力對籽油提取率的影響。

(3) 萃取時間對籽油提取率的影響：在萃取壓力30 MPa，萃取溫度50 ℃條件下，分別萃取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h，考察萃取時間對籽油提取率的影響。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗設計 在單因素試驗的基礎上，以萃取溫度、萃取壓力、萃取時間為自變量，以提取率為響應值，根據(jù)Box-Behnken中心旋轉組合設計，采用三因素三水平響應面分析法進行響應面分析，對百香果籽油萃取工藝進行優(yōu)化。

1.3.5 百香果籽油體外抗氧化活性測定

(1) DPPH·清除能力的測定：分別取不同質量濃度的百香果籽油溶液2 mL，各加入0.04 mg/mL的DPPH-乙醇溶液2.0 mL，混合均勻，于常溫下避光反應30 min，以無水乙醇為空白在517 nm波長處測吸光度，以VC為陽性對照，按式(2)計算DPPH·的清除率。

(2)

式中：

K——DPPH·清除率，%；

ADPPH——DPPH溶液的吸光度；

AS——添加百香果籽油或VC的DPPH溶液的吸光度。

(2) 還原力的測定：采用普魯士藍法測定百香果籽油還原Fe3+的能力[10]。分別取不同質量濃度的百香果籽油溶液1.0 mL，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL和1%的鐵氰化鉀溶液1.0 mL，充分搖勻混合，置于50 ℃恒溫水浴鍋中保溫25 min。冷卻后加入10%三氯乙酸溶液1 mL，充分混合，于3 500 r/min離心10 min后取上清液1.0 mL于試管中，再加入0.1% FeCl3溶液1.0 mL和蒸餾水2.0 mL，充分混勻，常溫反應5 min后于700 nm波長處測定其吸光度A1，甲醇代替百香果籽油溶液作為空白對照A0，以VC為陽性對照，按式(3) 計算百香果籽油的總還原能力。

(3)

式中：

A——百香果籽油的總還原能力，%；

A0——甲醇空白對照吸光度；

A1——百香果籽油溶液吸光度。

2 結果與分析

2.1 百香果籽油超臨界CO2萃取工藝的優(yōu)化

2.1.1 響應面法試驗設計 由單因素試驗可知，超臨界CO2萃取百香果籽油的較優(yōu)溫度范圍為45～55 ℃，壓力范圍為25～35 MPa，提取時間范圍在2～4 h。在此基礎上，采用響應面分析法對百香果籽油提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1，試驗結果見表2。

表1 響應面分析法的因素與水平

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results for response surface analysis

對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到擬合方程為：

Y=-180.788+5.758A+2.916B+1.698C+0.047AB+0.105AC+0.141BC-0.072A2-0.088B2-1.502C2。

(4)

2.1.2 回歸方程的檢驗 對回歸模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性。由表3可知，該模型極顯著(P<0.000 1)，且方差的失擬項不顯著(P=0.181 2>0.05)，表明非試驗因素對試驗結果影響不大，模型選擇適宜。決定系數(shù)R2為0.992 4，表明模型與實際試驗擬合程度較好，可以此模型對超臨界CO2萃取百香果籽油得率進行分析及預測。此外，從表3中還可看出，模型中A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2項影響均極顯著(P<0.01)，AC項影響也達到顯著水平。

2.1.3 響應面交互作用分析 圖1為萃取溫度、壓力和時間兩兩交互作用的響應面圖和等高線圖。

從等高線圖中可以看出，萃取溫度、壓力和時間兩兩之間均有顯著交互作用。從響應面圖中可以看出，提取率隨萃取溫度升高、壓力增大和時間的延長均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，表明在一定的范圍內萃取溫度、壓力和時間的增加，有利于百香果籽油的提取，但超過一定的溫度、壓力和時間，產物得率反而降低?？赡茉蛟谟冢孩?溫度的升高使CO2流體黏度降低，提高了溶質與溶劑間的傳質效率，且溶質的蒸汽壓上升使其溶解度增大，有利于溶質萃取,但溫度過高會使流體密度下降，導致其溶解度下降，不利于溶質的萃取;② 壓力升高使流體密度增大，流體的溶劑化效應加強，傳質效率增大，提取率增加,壓力過高則導致流體選擇性降低，溶質溶解增加變緩，不利于提取;③ 隨著萃取時間的延長，傳質達到良好的狀態(tài)，溶質與溶劑接觸充分，有利于萃取進行,但超過一定萃取時間，待萃組分含量明顯減少，傳質能力下降，導致萃取速率下降。

表3 回歸模型的方差分析

2.1.4 驗證實驗 采用響應面優(yōu)化百香果籽油提取工藝，確定最終優(yōu)化工藝條件為：萃取溫度53.1 ℃，萃取壓力33.9 MPa，萃取時間3.6 h，在此條件下產物得率為27.86%。為了檢驗該響應面法的可行性，利用所得最佳提取條件進行百香果籽油提取的驗證實驗。3次平行實驗結果的平均值為26.95%，與理論值相差0.91%，表明該響應面分析法對百香果籽油提取條件的優(yōu)化切實可行。

2.2 百香果籽油體外抗氧化活性

2.2.1 對DPPH·的清除能力 DPPH·是一種較為穩(wěn)定的自由基，在517 nm波長處有強吸收，其醇溶液呈紫色，被廣泛應用于評價抗氧化成分的自由基清除能力。自由基清除劑可與DPPH·的單電子配對，導致其在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度也隨之減小。DPPH·清除率越高，表明該物質抗氧化能力越大[11]。

由圖2可知，百香果籽油有顯著的清除DPPH·的活性，且清除率隨質量濃度的增加而增大，呈現(xiàn)較好的量效關系。以VC為參照，隨著樣品質量濃度的增加，百香果籽油對DPPH·的清除率逐漸增加，在質量濃度達10 mg/mL時，與VC接近，清除率達80%。

圖1 各因素交互作用對百香果籽油提取率的響應面和等高線圖

2.2.2 還原力測定 測定百香果籽油對Fe3+的還原力，本質是對其供電子能力進行檢驗。理論上，還原力強的物質能更好地提供電子。通常，樣品抗氧化能力的強弱可由其還原能力的大小間接反映出來。由圖3可知，不同質量濃度的百香果籽油和VC均對Fe3+具有一定的還原能力。盡管在相同質量濃度下百香果籽油的還原能力不如VC，但隨著質量濃度的增大，百香果籽油對Fe3+還原力也呈現(xiàn)不斷增高的趨勢。

圖2 百香果籽油對DPPH·的清除能力

圖3 百香果籽油還原Fe3+的能力

3 結論

采用超臨界CO2萃取法提取百香果籽油，通過響應面法對萃取工藝進行優(yōu)化，確定了最佳萃取條件為：萃取溫度53.1 ℃，萃取壓力33.9 MPa，萃取時間3.6 h。在此條件下，百香果籽油的得率為27.86%。體外抗氧化研究結果表明，百香果籽油具有較好的還原力，且對DPPH·清除力較強，呈量效依賴關系。Zahedi等[12]利用中心組合試驗設計優(yōu)化所得百香果籽油提取率為26.55%，何冬梅等[5]利用索氏提取法提取百香果籽油的得率為26.9%，程謙偉等[4]利用超聲波輔助提取得到的百香果籽油提取率為19.72%。相比之下，本研究所得優(yōu)化工藝條件下籽油提取率稍高，且超臨界CO2萃取后處理簡單，產物中無有機溶劑殘留，比傳統(tǒng)的試劑提取法更綠色、環(huán)保。綜合研究發(fā)現(xiàn)，超臨界CO2萃取百香果籽油的工藝穩(wěn)定可行，提取的百香果籽油具備天然的抗氧化活性，具有廣闊的開發(fā)前景，為百香果資源的進一步充分利用提供了理論依據(jù)。由于百香果籽油的含量和抗氧化性受產地、品種、成熟度等因素的影響，在后續(xù)的研究中，還有待進一步探索。

[1] 霍丹群, 蔣蘭, 馬璐璐, 等. 百香果功能研究及其開發(fā)進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(19): 391-395.

[2] 林日高. 沙田柚和西番蓮復合果汁飲料的研制[J]. 食品與機械, 2014, 30(4): 204-206.

[3] 許曉靜, 陶志華. 黃色和紫色百香果籽油抗氧化作用的對比研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(11): 49-52, 57.

[4] 程謙偉, 孟陸麗, 何仁, 等. 響應面優(yōu)化超聲波輔助提取百香果籽油工藝研究[J]. 糧油加工, 2010(8): 6-9.

[5] 何冬梅, 劉紅星, 黃初升, 等. 百香果籽揮發(fā)油的提取研究[J]. 中國釀造, 2010, 29(3): 150-153.

[6] 王亞琦, 陳奕洪, 黃衛(wèi)文, 等. 超臨界CO2萃取崖柏精油的研究[J]. 食品與機械, 2015, 31(3): 175-178.

[7] 李松, 吳光斌, 陳發(fā)河. 超臨界萃取琯溪蜜柚精油工藝優(yōu)化及組分分析[J]. 食品與機械, 2013, 29(1): 113-117.

[8] 付復華, 潘兆平, 謝秋濤, 等. 超臨界CO2萃取條件對紫蘇籽油脂肪酸組成的影響及工藝優(yōu)化[J]. 食品與機械, 2016, 32(7): 166-170.

[9] 曠春桃, 吳斌, 唐宏偉, 等. 山桐子油的超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化及脂肪酸組成分析[J]. 食品與機械, 2016, 32(11): 154-157.

[10] 張婷婷, 郭夏麗, 黃學勇, 等. 辛夷揮發(fā)油GC-MS分析及其抗氧化、抗菌活性[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 144-150.

[11] 李旭, 劉停. 杜仲葉總黃酮微波輔助提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013(4): 243-248.

[12] ZAHEDI G, AZARPOUR A. Optimization of supercritical carbon dioxide extraction of Passiflora, seed oil[J]. Journal of Supercritical Fluids, 2011, 58(1): 40-48.

Optimization of supercritical CO2extraction for passion fruit seed oil by response surface methodology and investigation of antioxidant activities of extracted oil in vitro

MAJin-kui1

LIKe2

WEIBing-dun1

YAOZi-ting1

HUANGXiao-chen3

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ZhaoqingUniversity,Zhaoqing,Guangdong526061,China;2.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China;3.CollegeofLifeScience,ZhaoqingUniversity,Zhaoqing,Guangdong526061,China)

The Box-Behnken design and response surface methodology (RSM) were employed to optimize the process parameters of supercritical carbon dioxide extraction of the passion fruit seed oil and the antioxidant activities of the extracts was also investigated in this study. Results obtained from the RSM showed that the optimum extraction process parameters within the experimental ranges would be the extraction temperature of 53.1 ℃, pressure of 33.9 MPa, and extraction time of 3.6 h. Under these conditions, the oil yield was 26.95%. The results of the antioxidant experimental also showed that the extracted oil have a potent reducing power and the relative antioxidant ability of oil to scavenge the DPPH· radicals was found to be 80%. Based on these results it can be concluded that supercritical carbon dioxide extraction could be applied to the oil extraction of the passion fruit and the extracted oil have shown promise as a natural antioxidant resource.

passion fruit; seed oil; supercritical CO2extraction; antioxidant activities

廣東省青年創(chuàng)新人才項目(編號：2016KQNCX176，2015KQNCX182)；廣東大學生科技創(chuàng)新培育專項資金(編號：pdjh2017b0552，pdjh2017b0550)；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：201610580057)

馬金魁，男，肇慶學院講師，博士。

李珂(1982—)，男，湖南農業(yè)大學實驗師，博士研究生。 E-mail: Leeke14@163.com

2017—05—16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.034