劉曉飛

王 鑫2

孟慶虹1

張 宇2

龔麗麗2

馬永強(qiáng)2

盧淑雯1

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150086；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

發(fā)芽糙米多糖雙水相萃取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

劉曉飛1,2

王 鑫2

孟慶虹1

張 宇2

龔麗麗2

馬永強(qiáng)2

盧淑雯1

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150086；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

以發(fā)芽糙米為原料，采用超聲波輔助雙水相法萃取對發(fā)芽糙米多糖的分配系數(shù)進(jìn)行研究，多糖得率作為考察目標(biāo)，通過正交試驗確定超聲波輔助雙水相萃取發(fā)芽糙米多糖的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：發(fā)芽糙米多糖最優(yōu)提取工藝為選用PEG6000、PEG6000添加量15.7%、硫酸銨添加量14.8%、萃取時間40 min，該條件下多糖得率為81.07%。并采用DPPH法、鄰苯三酚自氧化法和鄰二氮菲法檢測提取的多糖抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)芽糙米多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及羥基自由基均有較強(qiáng)的抗氧化作用。

發(fā)芽糙米；多糖；超聲波；雙水相萃??；抗氧化性

糙米是稻谷在加工過程中保留果皮、種皮、糊粉層和胚，經(jīng)礱谷僅脫去穎殼后的谷粒。糙米是一種全糧食品，是功能食品最好的來源，并且普遍具有多項保健功能[1]。糙米發(fā)芽時大量酶被激活和釋放，生成γ-氨基丁酸等有益的生物活性成分[2-3]，使發(fā)芽糙米具有抗氧化，降低血脂、降血壓、降血糖等作用，已被作為功能性食品配料和營養(yǎng)強(qiáng)化劑而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)中[4]。

雙水相萃取是一種新型的生物分離技術(shù)，具有分離條件溫和、傳質(zhì)速度快、成相時間短、能耗低、適合大規(guī)模操作、生物親和性好等優(yōu)點[5-6]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品化工、細(xì)胞生物學(xué)、生物工程、植物有效成分的分離等[7]。孫亞莉等[8]利用雙水相體系萃取分離葡萄籽多糖，分別考察了PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和萃取溫度3個因素對葡萄籽多糖的影響，最佳萃取率可達(dá)55.1%。Xing Jianmin等[9]采用雙水相萃取超濾膜結(jié)合的方法提取蘆薈多糖，結(jié)果顯示蘆薈多糖純度高，富含甘露糖單糖，且葡萄糖殘留物較少。劉琳等[10]利用乙醇/K2CO3雙水相實現(xiàn)一步操作分離提取樺褐孔菌發(fā)酵液中的三萜化合物和多糖，此方法分離效果好，有利于產(chǎn)品的后續(xù)純化。

目前對發(fā)芽糙米的研究主要集中在發(fā)芽工藝[11-13]、γ-氨基丁酸富集[14-15]、糙米發(fā)芽后營養(yǎng)物質(zhì)的變化情況[16-17]及以發(fā)芽糙米為原料的各種食品制作上[18-19]，目前中國尚無發(fā)芽糙米多糖提取的研究，因此，本試驗以發(fā)芽糙米為原料，采用聚乙二醇(PEG)/硫酸銨雙水相體系對萃取發(fā)芽糙米多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對多糖抗氧化性進(jìn)行研究，以期為發(fā)芽糙米多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

稻谷：龍粳，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 試驗儀器

超聲波細(xì)胞粉碎儀：JY92-ⅡD型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外可見分光光度計：SP-752PC型，上海光譜儀器有限公司；

臺式高速離心機(jī)：TGL-16G型，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HHS-12型，上海東星建材實驗設(shè)備有限公司；

電子分析天平：BS224S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糙米發(fā)芽 龔谷機(jī)去除稻谷外殼得到糙米，去除不完整的米粒和雜質(zhì)，將糙米放入去離子水中浸泡2 h，取出均勻平鋪托盤上，在恒溫恒濕箱中進(jìn)行發(fā)芽(溫度30 ℃、濕度98%、發(fā)芽24 h)[20]。80 ℃恒溫干燥箱中滅酶30 min后，55 ℃恒溫烘干，粉碎過篩(80目)備用。

1.3.2 總糖含量測定 采用苯酚硫酸法[19]。

1.3.3 雙水相萃取體系的制備 取發(fā)芽糙米粉10.0 g，加入蒸餾水，料液比1∶10 (g/mL)，超聲功率500 W超聲25 min[22]，超聲溫度50 ℃，冷卻至室溫，3 000 r/min 離心20 min，取上清液，蒸餾水定容至1 000 mL，待用。單因素試驗時每次取樣20 mL，稱取一定質(zhì)量的PEG，溶解后稱取不同質(zhì)量的硫酸銨，振蕩混合，靜置40 min。分相后記錄上下相體積，620 nm波長下檢測，計算出多糖在不同雙水相體系中的含量[21-22]。

(1)

(2)

(3)

式中：

K——發(fā)芽糙米多糖在PEG/硫酸銨兩相體系中的分配系數(shù)；

R——上下相體積之比；

Y——多糖在上相中的得率，%；

Ca——上相中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

Cb——下相中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

Va——上相體積，mL；

Vb——下相體積，mL。

1.3.4 發(fā)芽糙米多糖單因素優(yōu)化

(1) PEG分子質(zhì)量：發(fā)芽糙米多糖提取液20 mL，硫酸銨添加量5.0 g，分別加入4.0 g PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000，形成雙水相體系，于分液漏斗中萃取40 min。分相完全后，記錄上下相體積，研究發(fā)芽糙米中多糖的得率。

(2) PEG添加量：發(fā)芽糙米多糖提取液20 mL，硫酸銨添加量5.0 g，PEG6000添加量分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 g，形成雙水相體系，于分液漏斗中萃取40 min。分相完全后，記錄上下相體積，研究發(fā)芽糙米中多糖的得率。

(3) 硫酸銨添加量：發(fā)芽糙米多糖提取液20 mL，PEG6000添加量4.0 g，硫酸銨添加量分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 g，形成雙水相體系，于分液漏斗中萃取40 min。分相完全后，記錄上下相體積，研究發(fā)芽糙米中多糖的得率。

(4) 萃取時間：發(fā)芽糙米多糖提取液20 mL，硫酸銨添加量5.0 g，PEG6000添加量4.0 g，形成雙水相體系，于分液漏斗中萃取20，30，40，50，60 min。分相完全后，記錄上下相體積，研究發(fā)芽糙米中多糖的得率。

1.3.5 發(fā)芽糙米多糖抗氧化性的測定

(1) DPPH·清除率的測定：參照文獻(xiàn)[23]，按式(4)計算DPPH·清除率D。

(4)

式中：

D——DPPH·清除率，%；

A0——空白管吸光值；

Ai——多糖樣品吸光值；

Aj——多糖樣品對照組吸光值。

(5)

式中：

ΔA0——空白管吸光值；

ΔA——多糖樣品吸光值。

(3) 羥基自由基(·OH)清除率的測定：參照文獻(xiàn)[25]，按式(6)計算·OH清除率E。

(6)

式中：

E——·OH清除率，%；

A樣——多糖樣品吸光值；

A未——未損傷管的吸光值；

A損——損傷管的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖回歸方程：y=0.012x-0.003 5，R2=0.989 6，曲線相關(guān)性較好。

2.2 雙水相萃取發(fā)芽糙米的分配平衡單因素試驗

2.2.1 PEG分子量對發(fā)芽糙米多糖得率的影響 發(fā)芽糙米中多糖在不同雙水相體系中上下相溶液中的含量及多糖得率的結(jié)果見圖2～4。

圖2 分配系數(shù)K與PEG分子量的關(guān)系

圖3 上下相體積比與PEG分子量的關(guān)系

圖4 多糖得率與PEG分子量的關(guān)系

由圖2～4可知，在硫酸銨添加量一定的情況下，PEG相對分子質(zhì)量的變化，使得上下相體積比R有微小波動，但總體變化不大。而多糖分配系數(shù)K和多糖得率受PEG分子量影響較大，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增大，雙水相黏度增大，成相物質(zhì)分子的空間阻礙作用增加[8]，導(dǎo)致K值呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在PEG6000處有最大值，因此，PEG6000最有利于發(fā)芽糙米多糖在上相富集，得率為75.27%。

2.2.2 PEG添加量對發(fā)芽糙米多糖得率的影響 發(fā)芽糙米中多糖在不同雙水相體系中上下相溶液中的含量及得率見圖5～7。

由圖5～7可知，隨著PEG添加量的增加，上下相體積比R變化幅度不大，而分配系數(shù)K則呈現(xiàn)明顯的先增后減的趨勢，受此影響，多糖得率表現(xiàn)出同樣的走勢，并在PEG添加量達(dá)到15.7%時出現(xiàn)最大值(65.03%)，繼續(xù)增加PEG添加量會導(dǎo)致溶液的黏度很大，給生產(chǎn)過程帶來不利影響，并且多糖得率開始降低，與馬新輝等[28]的試驗結(jié)果相近。

圖5 分配系數(shù)K與PEG添加量的關(guān)系

圖6 上下相體積比與PEG添加量的關(guān)系

圖7 多糖得率與PEG添加量的關(guān)系

2.2.3 硫酸銨添加量對發(fā)芽糙米多糖得率的影響 發(fā)芽糙米多糖在不同雙水相體系中上下相溶液中的含量及得率見圖8～10。

由圖8～10可知，硫酸銨的添加量對上下相體積比和分配系數(shù)有較大影響，2組數(shù)據(jù)都隨著硫酸銨添加量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢；添加量為14.8%時，分配系數(shù)有最大，而上下相體積比最大值則出現(xiàn)在添加量為20.6%處。由此，綜合2組數(shù)據(jù)所得多糖得率總體變化不大，在硫酸銨添加量為14.8%處有最大值(73.25%)?？紤]到雙水相體系中硫酸銨添加量過大時，會造成硫酸銨不溶解，影響PEG的回收[27]，故選擇硫酸銨添加量為14.8%。

2.2.4 萃取時間對發(fā)芽糙米多糖得率的影響 發(fā)芽糙米中多糖在不同雙水相體系中上下相溶液中的含量及得率見圖11～13。

由圖11～13可知，時間因素對于整個雙水相萃取過程影響不大，上下相體積比和分配系數(shù)都隨萃取時間的延長逐漸增大，但變化幅度較小，當(dāng)時間增加至40 min時，曲線趨于平緩，不再增加，甚至還有較小程度的降低。原因可能是超聲波對多糖得率的影響起初起到促進(jìn)作用，超過一定時間后，超聲波會導(dǎo)致多糖的部分降解。所以確定萃取時間為40 min最適宜。

圖8 分配系數(shù)K與硫酸銨添加量的關(guān)系

圖10 多糖得率與硫酸銨添加量的關(guān)系

圖11 分配系數(shù)K與萃取時間的關(guān)系

圖12 上下相體積比與萃取時間的關(guān)系

圖13 多糖得率與萃取時間的關(guān)系

2.3 超聲波輔助雙水相萃取多糖的正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖得率為評價指標(biāo)，對PEG分子量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、萃取時間進(jìn)行正交試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表1、2。

由表2可知，各因素對多糖得率的影響大小順序為：PEG分子量>硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)>PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)>萃取時間。正交試驗最優(yōu)組合A2B3C2D2，即選用PEG6000、PEG6000添加量15.7%、硫酸銨添加量14.8%、萃取時間40 min，在此條件下進(jìn)行驗證實驗，重復(fù)3次，取其平均值，多糖得率為81.07%。

2.4 發(fā)芽糙米多糖抗氧化活性

2.4.1 DPPH法測定發(fā)芽糙米多糖抗氧化性 發(fā)芽糙米多糖濃度與DPPH·的清除關(guān)系見圖14。

表1 正交設(shè)計試驗

表2 多糖提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

圖14 多糖濃度與DPPH·清除的關(guān)系

Figure 14 Scavenging effect of polysaccharide from germinated brown rice by DPPH· method

由圖14可知，DPPH·的清除率隨著發(fā)芽糙米多糖濃度的增加而增大，呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)葡萄糖濃度為0.6 mg/mL時，DPPH·清除率達(dá)到81.85%。說明發(fā)芽糙米多糖具有良好的DPPH·清除活性。

由圖15可知，多糖濃度<0.3 mg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除能力基本保持在55%左右，之后繼續(xù)增大多糖濃度，其清除超氧陰離子自由基的能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mg/mL時，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到68.77%，說明發(fā)芽糙米多糖對超氧陰離子自由基具有較好清除作用。

圖15 多糖濃度與超氧陰離子自由基清除的關(guān)系

2.4.3 鄰二氮菲法測定發(fā)芽糙米多糖抗氧化性 發(fā)芽糙米多糖濃度與羥基自由基(·OH)的清除關(guān)系見圖16。

由圖16可知，對羥基自由基的清除能力隨多糖濃度升高逐漸增強(qiáng)，當(dāng)發(fā)芽糙米多糖濃度達(dá)到0.5 mg/mL時，趨于穩(wěn)定，羥基自由基清除率約為53%，抗氧化性最強(qiáng)。與黃越等[29]的研究結(jié)果相似。

圖16 多糖濃度與羥基自由基清除的關(guān)系

Figure 16 Scavenging effect of polysaccharide from germinated brown rice by ·OH method

3 結(jié)論

經(jīng)對影響多糖得率的因素進(jìn)行單因素試驗，并通過正交試驗確定超聲波輔助雙水相法萃取發(fā)芽糙米多糖的最佳工藝條件為：選用PEG6000、PEG6000添加量15.7%、硫酸銨添加量14.8%、萃取時間40 min，此條件下多糖得率為81.07%。萃取過程簡單可行，可以進(jìn)一步優(yōu)化雙水相的組分以期得到收率更高的發(fā)芽糙米多糖。

發(fā)芽糙米多糖具有較強(qiáng)的抗氧化作用，對DPPH自由基、超氧陰離子以及羥基自由基清除率分別達(dá)到81.85%，68.77%，53.00%。發(fā)芽糙米多糖可以作為一種良好的抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)利用。

[1] 孟春玲, 孟慶虹, 張守文. 發(fā)芽糙米的營養(yǎng)功能和進(jìn)一步開發(fā)利用[J]. 中國食品添加劑, 2014(5): 156-160.

[2] 曾丹, 李遠(yuǎn)志, 陳友清, 等. 酶解工藝對改善發(fā)芽糙米口感的影響[J]. 食品與機(jī)械, 2011, 27(6): 71-74.

[3] CHO Dong Hwa, LIM Seung Taik. Germinated brown rice and its bio-functional compounds[J]. Food Chemistry, 2016, 196(8): 259-271.

[4] 劉嵐, 尹珺, 譚鈐文. 幾種發(fā)芽糙米食品感觀評價研究[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2009(10): 1-4.

[5] FREIRE Mara G, CLAUDIO Ana Filipa M, ARAUJO J M, et al. Aqueous biphasic systems: a boost brought about by using ionic liquids[J]. Chem Soc Rev, 2012, 41(14): 4 966-4 955.

[6] 謝藍(lán)華, 杜冰, 張嘉怡, 等. 雙水相萃取技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(5): 234-238.

[7] 馬永強(qiáng), 荊麗榮, 劉曉飛. 雙水相超聲波法輔助提取甜玉米多酚及抑菌性研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(24): 61-64.

[8] 孫亞莉, 張瑾, 裴淑平, 等. 雙水相體系萃取分離葡萄籽多糖[J]. 中國釀造, 2013, 32(7): 89-93.

[9] XING Jian-min, LI Fen-fang. Separation and purification of aloe polysaccharides by a combination of membrabe ultrafiltration and aqueous two-phase extraction[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2009, 158(1): 11-19.

[10] 劉琳, 宋麗敏. 樺褐孔菌發(fā)酵液中三萜化合物和多糖的微波輔助雙水相萃取[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(5): 246-252.

[11] 江湖, 付金衡, 蘇虎, 等. 富鈣發(fā)芽糙米的生產(chǎn)工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(16): 83-85.

[12] 張強(qiáng), 鄭先哲, 賈富國, 等. 循環(huán)加濕工藝降低發(fā)芽糙米爆腰增率并提高得率[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2013, 29(11): 241-247.

[13] 周艷華, 李濤. 糙米發(fā)芽富集γ-氨基丁酸工藝優(yōu)化的研究[J]. 糧食與食品工業(yè), 2013, 20(5): 17-20.

[14] 耿程欣, 楊潤強(qiáng), 顧振新. 活性化糙米富集γ-氨基丁酸的霧化液組分優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2015, 63(6): 35-39.

[15] 鄭藝梅. 發(fā)芽糙米營養(yǎng)特性γ-氨基丁酸富集及生理功效的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[16] 鮑會梅. 糙米發(fā)芽過程中主要營養(yǎng)成分變化的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2016, 37(22): 27-31.

[17] 丁俊胄, 劉貞, 趙思明, 等. 糙米發(fā)芽過程中內(nèi)源酶活力及主要成分的變化[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(11): 29-32.

[18] 曹磊, 夏青, 宋玉. 親水膠體對發(fā)芽糙米面包品質(zhì)特性的影響[J]. 食品與機(jī)械, 2017, 33(1): 174-178.

[19] 謝潔, 周劍新, 蒲海燕. 發(fā)芽糙米粉饅頭制作工藝研究[J]. 糧食與油脂, 2016, 29(11): 10-12.

[20] 羅曦, 曾亞文, 楊樹明, 等. 不同發(fā)芽時間下發(fā)芽稻谷和糙米不同部位γ-氨基丁酸含量差異[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(13): 124-128.

[21] 徐海軍, 孫稹稹. 應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)提取香菇多糖的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013(25): 982-985.

[22] 王鑫, 高爽, 謝靜南. 異丙醇—硫酸銨雙水相體系分離甜玉米多糖[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(23): 170-175.

[23] 秦微微, 金婷, 宋學(xué)東, 等. 雙水相萃取米糠多糖工藝條件的探究[J]. 中國調(diào)味品, 2014, 39(3): 54-58.

[24] 五江, 班立桐. 應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)提取雙孢菇多糖的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2011, 32(7): 4-6.

[25] 張春雪, 田智宇, 王振興, 等. 核桃皮多糖微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(7): 146-151.

[26] 何玲玲, 王新, 劉彬, 等. 板栗多糖的分離純化及抗氧化活性研究[J]. 食品與機(jī)械, 2010, 26(2): 72-75.

[27] GEORGE Z, GIOKAS D, VLESSIDIS A. The effects of solvent preoxidation on in hibited chemiluminescence of pyrogallol oxidation in flow injection analysis and liquid chromatography[J]. Analytica Chimica Acta, 2006, 565(1): 56-62.

[28] 馬新輝, 李榮庭, 趙曉涵. 雙水相體系萃取藍(lán)莓多糖的分配平衡研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(3): 211-220.

[29] 黃越, 周春暉, 黃惠華. 不同提取方法猴頭菇粗多糖的表征及其抗氧化活性的比較[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(3): 80-86.

Extraction of polysaccharide from germinated brown rice by aqueous two-phase system and research of its antioxidant activity

LIUXiao-fei1,2

WANGXin1

MENGQing-hong1

ZHANGYu2

GONGLi-li2

MAYong-qiang2

LUShu-wen1

(1.HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciencesPostdoctoralProgramme,Harbin,Heilongjiang150086,China; 2.KeyLaboratoryforFoodScienceandEngineering,HarbinUniversityofCommerce,Harbin,Heilongjiang150076,China)

The polysaccharide was extracted by the ultrasonic-assisted aqueous two-phase technology from germinated brown rice. The phase separation ability of different in PEG/(NH4)2SO4system was studied according to the polysaccharide yield. The yield of polysaccharide substance of germinated brown rice was determined by orthogonal experiment. The optimum process conditions were determined. Results were showed as follows: the mass fraction of PEG6000 was 15.7%, the mass fraction of ammonium sulfate was 14.8% and extraction time was 40 min. The yield of polysaccharide substance from germinated brown rice was 81.07% in the optimum conditions. Morever, the anti-oxidation of polysaccharide substance from germinated brown rice were studied by methods of DPPH, pyrogallol autoxidation and phenanthroline. The results showed that the polysaccharide of brown rice had stronger antioxidant effect to DPPH, ultra oxygen anion and hydroxyl radicals.

Germinated brown rice; polysaccharide; ultrasonic; two-phase extraction; antioxidant activity

黑龍江省博士后資助經(jīng)費(編號：LBH-Z15200)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(編號：12541189)

劉曉飛，女，哈爾濱商業(yè)大學(xué)副教授，博士。

盧淑雯(1968—)，女，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究員，博士。E-mail：shuwenl@sina.com

2017—05—16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.033