李良德，王定鋒，李慧玲，張 輝，曾明森，吳光遠(yuǎn)

茶小綠葉蟬代謝解毒基因CYP303A1的克隆及生物信息學(xué)分析

李良德，王定鋒，李慧玲，張 輝，曾明森，吳光遠(yuǎn)*

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

CYP303A1基因是細(xì)胞色素P450（簡(jiǎn)稱(chēng)P450）家族成員之一，它在昆蟲(chóng)藥物代謝解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)RT－PCR方法克隆了茶小綠葉蟬Empoasca flavescens CYP303A1基因編碼區(qū)ORF，并通過(guò)生物信息學(xué)軟件和在線網(wǎng)站對(duì)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、氨基酸多重序列比對(duì)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能域進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，CYP303A1基因含有1503 bp開(kāi)放閱讀框，編碼500個(gè)氨基酸，分子量為57.42 k Da，理論等電點(diǎn)為8.56。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，CYP303A1基因與同翅目的煙粉虱Bemisia tabaci親緣關(guān)系最近，與膜翅目的榕小蜂Ceratosolen solmsi親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。氨基酸系列比對(duì)結(jié)果表明，CYP303A1基因與其他物種昆蟲(chóng)CYP303A1的保守性較差。三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能域分析結(jié)果表明，該蛋白以β折疊為主，功能域由一信號(hào)肽和p450蛋白域（Pfam：p450）組成。該研究明確了茶小綠葉蟬CYP303A1的核苷酸序列及編碼蛋白特征。

茶小綠葉蟬；CYP303A1基因；克?。簧镄畔W(xué)；殺蟲(chóng)劑

福建省現(xiàn)有茶園370萬(wàn)畝，茶樹(shù)害蟲(chóng)種類(lèi)繁多。茶小綠葉蟬Empoasca flavescens，隸屬同翅目（Homoptera）葉蟬科（Cicadellidae），是茶樹(shù)上的頭號(hào)害蟲(chóng)，也是茶樹(shù)病蟲(chóng)害防治工作的首要對(duì)象［1］。目前，可供選擇防治該蟲(chóng)的藥劑極少，導(dǎo)致了茶農(nóng)長(zhǎng)期單一使用同一類(lèi)殺蟲(chóng)劑，從而導(dǎo)致茶小綠葉蟬抗藥性增強(qiáng)，防效顯著下降，蟲(chóng)害連年暴發(fā)。如2000年初，王念武等發(fā)現(xiàn)壽寧茶場(chǎng)的小綠葉蟬對(duì)阿克泰、莫比朗、吡蟲(chóng)啉等農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗性，特別是阿克泰的抗性達(dá)到了13.3倍［2］；2009年，莊家祥等發(fā)現(xiàn)在武夷山茶場(chǎng)和福安茶場(chǎng)茶小綠葉蟬對(duì)啶蟲(chóng)脒的抗性倍數(shù)達(dá)到了52.3和97.4倍，抗性水平進(jìn)一步提升［3］；最近，李建宇等發(fā)現(xiàn)福州、南平、泉州和寧德主產(chǎn)茶區(qū)的茶小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯和啶蟲(chóng)脒已達(dá)到高抗水平［4］。由此可見(jiàn)，茶小綠葉蟬的抗藥性出現(xiàn)了逐年加重的現(xiàn)象。

害蟲(chóng)具有較為復(fù)雜的抗藥性機(jī)制，導(dǎo)致害蟲(chóng)抗性產(chǎn)生的主要原因有：殺蟲(chóng)劑對(duì)表皮的穿透力降低，昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的解毒代謝增強(qiáng)和殺蟲(chóng)劑對(duì)作用靶標(biāo)的敏感性降低。其中昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450酶（Cytochrome P450 enzyme，簡(jiǎn)稱(chēng)P450）對(duì)殺蟲(chóng)劑的解毒代謝作用增強(qiáng)，是導(dǎo)致昆蟲(chóng)對(duì)靶標(biāo)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的主要原因［5］。1958年最早發(fā)現(xiàn)P450蛋白是一類(lèi)含有亞鐵血紅素和硫醇鹽的蛋白酶，它能與CO結(jié)合并在450 nm處有較強(qiáng)吸收峰，因此而得名［6，7］。到目前為止，已在數(shù)十種昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)多種P450家族成員（如CYP3，CYP4和CYP6等），且每個(gè)家族又具有多個(gè)亞族基因，其中CYP3家族與農(nóng)藥的解毒代謝及昆蟲(chóng)免疫密切相關(guān)。

研究表明，CYP3主要通過(guò)相應(yīng)的酶活性的增加或其酶表達(dá)量的增加，導(dǎo)致害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性［8，9］。例如，棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera CYP337B3具有催化氰戊菊酯的羥基化作用，最終導(dǎo)致棉鈴蟲(chóng)對(duì)氰戊菊酯產(chǎn)生抗藥性［5］。又如對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯產(chǎn)生抗性的棉鈴蟲(chóng)與CYP337B3的上調(diào)表達(dá)密切相關(guān)［10］。因此，開(kāi)發(fā)基于以茶小綠葉蟬CYP303A1為靶標(biāo)的新殺蟲(chóng)劑對(duì)解決茶小綠葉蟬抗藥性具有重要的意義。本研究采用RT－PCR技術(shù)從茶小綠葉蟬中克隆得到CYP303A1基因的編碼區(qū)ORF全長(zhǎng)，并對(duì)該基因編碼的蛋白序列進(jìn)行了分子量、等電點(diǎn)和疏水性分析；同時(shí)構(gòu)建了該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并比對(duì)了氨基酸序列圖譜；最后，對(duì)其特殊的三級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白功能域進(jìn)行了分析模擬。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)及取樣

試驗(yàn)昆蟲(chóng)茶小綠葉蟬，采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)茶園（福建省福安市社口鎮(zhèn)，北緯27°8′～27°13′，東經(jīng)119°32′～119°38′）。采用捕蟲(chóng)網(wǎng)來(lái)回S型路線繞茶園將茶小綠葉蟬收集于捕蟲(chóng)網(wǎng)中，并收集3～4齡茶小綠葉蟬若蟲(chóng)于1.5 m L離心管中（每管150頭），保存于－80℃中備用。

1.2 主要試劑

總RNA提?。‥.Z.N.A.TMTotal RNA Kit）及反轉(zhuǎn)試劑盒（Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA回收凝膠試劑盒購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖凝膠、d NTPs（濃度2.5 mmol·L－1）、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）、載體p MD20－T和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）均為T(mén)a KaRa公司購(gòu)買(mǎi)。本試驗(yàn)所用引物的合成和菌樣的測(cè)序均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.3 總RNA提取及cDNA模板的合成

將預(yù)先備好的3～4齡茶小綠葉蟬若蟲(chóng)（每管150頭）液氮冷凍后，參照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，研磨提取總RNA，并用電泳檢測(cè)（2%瓊脂糖凝膠）所提取RNA的完整性。參照總RNA反轉(zhuǎn)試劑盒說(shuō)明書(shū)，于20μL混合體系中加入1μg總RNA反轉(zhuǎn)構(gòu)建cDNA模板。

1.4 茶小綠葉蟬CYP303A1基因RT－PCR擴(kuò)增

根據(jù)已獲得的茶小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，從中挑選出茶小綠葉蟬CYP303A1的基因片段，分析得知該片段包含完整編碼區(qū)ORF。為驗(yàn)證獲得的堿基序列，首先在ORF的起始密碼子兩端設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物CAGGCTATATCCTGCAAA／TGAC ATCGTCTTGCGACC進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增。進(jìn)而在終止密碼子的兩端設(shè)計(jì)另一交叉兼并引物ACGAGTGTATCAAGGAGAT／CAACATCTTT ATTGCTATA，RT－PCR擴(kuò)增獲得茶小綠葉蟬CYP303A1的ORF全序列。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃3 min；95℃30 s，62℃1 min，72℃45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃6 min；4℃，保存?zhèn)溆谩Ｗ詈?，將所克隆的目的條帶用瓊脂糖凝膠回收并與p MD20－T載體進(jìn)行重組，導(dǎo)進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性白斑進(jìn)行序列測(cè)序。

1.5 茶小綠葉蟬CYP303A1基因生物信息學(xué)分析

茶小綠葉蟬CYP303A1序列由DNAstar軟件去除重復(fù)序列拼接獲得；蛋白質(zhì)理化信息通過(guò)ProtParam在線網(wǎng)站分析獲得；氨基酸多重序列比對(duì)由Multalin 5.4.1在線網(wǎng)站比對(duì)獲得；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)由MEGA 7.0采用1000次重復(fù)分析制作獲得（比對(duì)方法：neighbor－joining，NJ）；三級(jí)結(jié)構(gòu)由Swiss Model在線網(wǎng)站模擬獲得；蛋白功能域由SMART在線網(wǎng)站分析獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶小綠葉蟬CYP303A1基因的克隆

通過(guò)設(shè)計(jì)的兩對(duì)簡(jiǎn)并引物，分別擴(kuò)增獲得大小為465 bp（圖1：泳道2）和1884 bp（圖1：泳道1）的前后兩個(gè)條帶，再將所獲得的前后條帶去除重復(fù)序列，拼接得到2161 bp的全序列。

圖1 茶小綠葉蟬CYP303A1基因的克隆Fig.1 Cloning of CYP303A1 cDNA from Empoasca flavescens

采用DNAstar軟件對(duì)該基因進(jìn)行拼接，結(jié)果表明CYP303A1基因含有1503 bp開(kāi)放閱讀框，編碼500個(gè)氨基酸（圖2）。采用ProtParam在線網(wǎng)站對(duì)編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白分子式為C2608H4062N682O720S29，總平均疏水性為－0.219，理論等電點(diǎn)為8.56，分子量為57.42 kDa。

圖2 茶小綠葉蟬CYP303A1編碼的氨基酸序列Fig.2 Aminoacid sequence of CYP303A1 from E.flavescens

2.2 茶小綠葉蟬CYP303A1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)NCBI Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬CYP303A1基因與煙粉虱Bemisia tabaci（XM＿ 019040732.1）、溫帶臭蟲(chóng)Cimex lectularius（XM＿014391468.1）、茶翅蝽Halyomorpha halys（XM＿014430413.1）、柑橘木虱Diaphorina citri（XM＿017445374.1）、紅火蟻Orussus abietinus（KM217008.1）、豌豆長(zhǎng)管蚜Acyrthosiphon pisum（XM＿001951058.4）、白背飛虱Sogatella furcifera（KX660712.1）、小菜蛾P(guān)lutella xylostella（XM＿011554832.1）、蠅蛹金小蜂N(xiāo)asonia vitripennis（NM＿001167774.1）、蕪菁葉蜂Athalia rosae（XM＿012401354.2）、灰飛虱Laodelphax striatell a（JX462969.1）、短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum（XM＿014366947.1）、榕小蜂Ceratosolen solmsi（XM＿011496884.1）基因的親緣關(guān)系依次降低。將以上序列下載并制成fasta格式文檔，由MEGA 7.0軟件制作獲得系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。由圖中可知，該基因與同翅目的煙粉虱Bemisia tabaci親緣關(guān)系最近，與膜翅目的榕小蜂Ceratosolen solmsi親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 茶小綠葉蟬CYP303A1氨基酸多重序列比對(duì)

通過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬CYP303A1基因與其他物種昆蟲(chóng)CYP303A1的保守性較差，其中與同翅目煙粉虱Bemisia tabaci（XM＿019040732.1）和白背飛虱Sogatella furcifera（KX660712.1）保守性最高，為67%，與半翅目茶翅蝽Halyomorpha halys（XM＿014430413.1）、溫帶臭蟲(chóng)Cimex lectularius（XM＿014391468.1）、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum（XM＿001951058.4）和褐飛虱Nilaparvata lugens（KM217008.1）的保守性為66%、與鱗翅目小菜蛾P(guān)lutella xylostella（XM＿011554832.1）的保守性為65%。將以上保守氨基酸下載制成fasta格式文檔，通過(guò)Multalin 5.4.1在線網(wǎng)站比對(duì)獲得了茶小綠葉蟬CYP303A1的氨基酸多重序列比對(duì)圖（圖4）。從圖4中分析得出，8個(gè)物種CYP303A1蛋白除個(gè)別氨基酸保所外（如308～319），其余部分基本不相同，表明茶小綠葉蟬CYP303A1與其他昆蟲(chóng)較不保守。

2.4 茶小綠葉蟬CYP303A1三級(jí)結(jié)構(gòu)與功能域分析

將茶小綠葉蟬CYP303A1編碼蛋白導(dǎo)入Swiss Model在線網(wǎng)站進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果表明該蛋白主要以β折疊為主，中間以部分α螺旋進(jìn)行連接（圖5）。

采用Smart網(wǎng)站對(duì)該編碼序列進(jìn)行功能域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白功能域結(jié)構(gòu)單一，分別由1～20位氨基酸編碼的信號(hào)肽（signal peptide）和27～494位氨基酸編碼的p450蛋白域（Pfam：p450）組成（圖6）。

圖3 茶小綠葉蟬CYP303A1基因的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of CYP303A1 gene from E.flavescens注：數(shù)字的大小表示不同物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

圖4 茶小綠葉蟬CYP303A1多重序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of CYP303A1 from E.flavescens注：保守性由紅色、藍(lán)色和黑色逐步降低。

圖5 茶小綠葉蟬CYP303A1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of CYP303A1 from E.flavescens

3 結(jié)論與討論

本研究首次克隆了茶小綠葉蟬CYP303A1基因的全編碼區(qū)ORF，該序列全長(zhǎng)2161 bp，含有1503 bp開(kāi)放閱讀框，編碼500個(gè)氨基酸，分子量為57.42 k Da，理論等電點(diǎn)為8.56，這與其他物種昆蟲(chóng)，如煙粉虱Bemisia tabaci、白背飛虱Sogatella furcifera、茶翅蝽Halyomorpha halys、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum等的CYP303A1基因基本類(lèi)似，明確了獲得的序列為茶小綠葉蟬CYP303A1基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)比對(duì)表明，茶小綠葉蟬CYP303A1基因與同翅目昆蟲(chóng)煙粉虱Bemisia tabaci親緣關(guān)系最近，這與茶小綠葉蟬隸屬同翅目昆蟲(chóng)結(jié)果相符；但其氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬CYP303A1蛋白氨基酸序列除個(gè)別位點(diǎn)保守外，其余部分基本不相同，可能暗示茶小綠葉蟬CYP303A1基因在長(zhǎng)期參與藥物解毒或免疫過(guò)程中受外來(lái)物質(zhì)的誘導(dǎo)，導(dǎo)致多處堿基發(fā)生突變。這種現(xiàn)象在抗性昆蟲(chóng)中也有存在，如棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera抗氰戊菊酯品系的CYP687基因編碼區(qū)共有14個(gè)堿基發(fā)生突變，并最終引起3個(gè)氨基酸發(fā)生改變［11］。抗溴氰菊酯的淡色庫(kù)蚊Culex pipiens pallens的P450 CYP4家族（CYP4C、CYP4D、CYP4 H）亦存在多基因位點(diǎn)突變［12］。本研究中茶小綠葉蟬多處堿基發(fā)生突變，可能因?yàn)樵撓x(chóng)采集于常規(guī)試驗(yàn)茶園，推測(cè)其CYP303A1基因可能受長(zhǎng)年施藥的誘導(dǎo)，導(dǎo)致保守性降低。

另外，信號(hào)肽具有引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的功能，它能引導(dǎo)靶標(biāo)蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，隨即被腔內(nèi)表面的信號(hào)肽酶水解脫離，最終被分泌到胞外。本研究對(duì)茶小綠葉蟬CYP303A1蛋白功能域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有由20位氨基酸組成的一短信號(hào)肽，暗示茶小綠葉蟬CYP303A1信號(hào)肽在參與有毒物質(zhì)解毒、排毒過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，但具體功能有待后續(xù)做進(jìn)一步研究。

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Cloning and Bioinformatics of Metabolic Detoxication Gene，CYP303A1，in Empoasca flavescens（Hemoptera：cicadas）

LI Liang-de，WANG Ding-feng，LI Hui-ling，ZHANG Hui，ZENG Ming-sen，WU Guang-yuan*
（Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)u’an，F(xiàn)ujian 355015，China）

CYP303A1 gene belongs to the cytochrome P450 family.It plays an important role in metabolic detoxification of insecticides for insects.This study cloned the complete open reading frame（ORF）of CYP303A1 from Empoasca flavescens using RT－PCR.The physicochemical properties，phylogenetic tree，amino acid sequence，tertiary structure and functional domain of the gene were analyzed with the bioinformatics software and information from online sources.The results showed that the gene had a 1，503 bp ORF encoding 500 amino acids with a molecular weight of 57.42 kDa and a theoretical isoelectric point of 8.56.The phylogenetic tree analysis on the gene indicated that it had the highest genetic relationship with Bemisia tabaci（Homoptera）and the lowest with Ceratosolen solmsi（Hymenoptera）.The amino acid sequence of the gene poorly conserved with those of other insects，and the structure was primaryβ-sheet with its functional domain consisting of a signal peptide and pfam：p450.This study unveiled the nucleotide sequence and encoded amino acid characteristics of CYP303A1 from E.flavescens which would lead to the designing of a target insecticide for better control of E.flavescens on tea plants.

Empoasca flavescens；CYP303A1 gene；clone；bioinformatics；insecticide

S435.711

A

2096－0220（2017）02－0041－05

2017－03－21初稿；2017－04－29修改稿

福建省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)（2017R1102、2014R1012－5）；國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS－23）；福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（2014NK04）。

李良德（1988－），男，助理研究員，主要從事昆蟲(chóng)生理學(xué)和毒理學(xué)研究。E－mail：787834208＠qq.com

*通訊作者：吳光遠(yuǎn)（1962－），男，研究員，主要從事茶樹(shù)植保與害蟲(chóng)生物防治研究。E－mail：gywupt＠163.com