岳東旭， 趙娟娟， 張憶雄， 丁 濤， 陳慧子， 徐 林△

(遵義醫(yī)學(xué)院 1免疫學(xué)教研室暨貴州省生物治療人才基地，2貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

微小RNA-7敲減對ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的影響*

岳東旭1, 2， 趙娟娟1, 2， 張憶雄1, 2， 丁 濤1, 2， 陳慧子1, 2， 徐 林1, 2△

(遵義醫(yī)學(xué)院1免疫學(xué)教研室暨貴州省生物治療人才基地，2貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

目的： 研究微小RNA-7(miR-7)敲減(KD)對急性肝損傷(ALI)模型小鼠的影響。方法: 野生型(WT)小鼠和miR-7KD小鼠腹腔注射30 mg/kg刀豆蛋白(ConA)建立急性肝損傷模型；48 h后，觀察小鼠肝臟的形態(tài)、重量及其臟器指數(shù)變化；HE染色觀察小鼠肝臟組織病理學(xué)變化；血清學(xué)方法檢查血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平；ELISA法檢測血清中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測肝臟組織中CD4+T細(xì)胞的比例及其相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的表達(dá)變化。結(jié)果: 與對照組相比，miR-7敲減后急性肝損傷小鼠的肝臟組織顏色變淺，重量減輕，重量指數(shù)明顯增加(P<0.05)；HE染色顯示miR-7KD小鼠血清炎癥細(xì)胞浸潤顯著增多；血清學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)急性肝損傷小鼠血清ALT的水平明顯上升(P<0.05)；ELISA法檢測顯示miR-7KD小鼠血清中IFN-γ水平明顯升高(P<0.01)，而IL-4的表達(dá)水平則明顯降低(P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，miR-7KD小鼠肝臟中CD4+T細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)，其相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平也顯著上調(diào)(P<0.01)，而IL-4的水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化。結(jié)論: 敲減miR-7基因可明顯促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。

微小RNA-7； 急性肝損傷； CD4+T細(xì)胞

急性肝損傷(acute liver injury，ALI)是肝細(xì)胞較短時間內(nèi)發(fā)生損傷，功能迅速喪失或降低，伴有凝血功能障礙、黃疸等癥狀，常發(fā)展為肝性腦病的一種臨床綜合征[1]。大量研究顯示，微小RNA(microRNA，miRNA，miR)與急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。微miR-7作為miRNAs家族重要成員之一，在肝臟相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[3-4]。然而，miR-7在急性肝損傷發(fā)生中的可能作用及相關(guān)機(jī)制仍未有研究報道。近年來，我們課題組發(fā)現(xiàn)，miR-7不僅參與了機(jī)體免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能的變化，還與炎癥相關(guān)臨床疾病的發(fā)生過程密切相關(guān)[5-6]，提示miR-7與機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)。因此，在本研究中，我們利用前期構(gòu)建的miR-7敲減(knockdown，KD)小鼠，首次觀察miR-7基因敲減對刀豆蛋白A(concanavalin A， ConA)誘導(dǎo)的急性免疫肝損傷模型小鼠的可能影響，為后續(xù)進(jìn)一步探討急性肝損傷的發(fā)生機(jī)制以及尋找診斷治療新靶點(diǎn)提供新的策略和前期數(shù)據(jù)。

材料和方法

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級8～12周齡的FVB/N背景野生型(wild type，WT)小鼠和FVB/N背景miR-7KD小鼠[7-8]均飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)中心SPF級動物實(shí)驗(yàn)室。

2主要試劑和儀器

4%多聚甲醛(重慶川東化工公司)；HE染色液(泰康醫(yī)療)；IC fixation buffer、Permeabilization buffer及抗小鼠CD4-PE、IFN-γ-PC5.5、IL-4-APC流式抗體(eBioscience)。SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；IX-51倒置顯微鏡和IX-71倒置熒光顯微鏡(Olympus)；低溫高速離心機(jī)(Thermo)；流式細(xì)胞分析儀(Beckman Coulter)。

3主要方法

3.1急性肝損傷模型的建立 用ConA以30 mg/kg小鼠體重的劑量腹腔注射[9]，48 h后采集相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

3.2觀察小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化 斷頸法處死造模成功的WT小鼠和miR-7KD小鼠，取小鼠的肝臟組織，觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化、測量肝臟重量并計算重量指數(shù)(重量指數(shù)=小鼠待測臟器重量/小鼠重量)。

3.3HE染色檢測小鼠肝臟組織病理變化 斷頸法處死造模成功的WT小鼠和miR-7KD小鼠，分別取所要觀察小鼠的肝臟組織，4%甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片(5 μm)，行HE染色，顯微鏡下觀察其組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化。

3.4血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)的水平檢測 摘除造模成功的WT小鼠和miR-7KD小鼠的眼球，收集血液，然后室溫放置2 h待血液凝固，經(jīng)2 000 r/min離心20 min，收集血清送至遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行生化指標(biāo)ALT的檢測。

當(dāng)前IoT系統(tǒng)普遍存在多個管理域，如智慧小區(qū)、智慧學(xué)校、智慧醫(yī)院等，出于安全考慮，不同管理域之間是彼此“絕緣”的，如何實(shí)現(xiàn)IoT跨域的互聯(lián)互通及相關(guān)安全協(xié)議的研究成為新型IoT安全增強(qiáng)技術(shù)的重要目標(biāo)之一。

3.5ELISA法檢測血清中的細(xì)胞因子水平的變化 每個樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、空白對照和可選對照樣品均加做副孔，每個微孔加400 μL洗滌緩沖液洗滌2次，之后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，建立濃度梯度，每個樣品孔加入50 μL的樣品稀釋液，并向每個微孔加入50 μL的生物素抗體，孵育2 h，棄去微孔內(nèi)的液體，洗板6次，每個微孔加入100 μL的蛋白鏈菌素-HRP，孵育1 h，棄去微孔內(nèi)的液體，洗板6次，每個微孔加入100 μL TMB顯色，孵育10 min，標(biāo)準(zhǔn)孔顯色為暗藍(lán)色時候加入終止液，使用分光光度計以主波長450 nm 檢測各微孔吸光度。

3.6單細(xì)胞懸液的制備 斷頸法處死待檢測小鼠，于75%的乙醇內(nèi)浸泡5 min，在超凈臺中取出小鼠肝臟組織后置于加有10 mL PBS緩沖液的平皿中，然后于200目無菌細(xì)胞篩上研磨組織，分別過濾2次；將獲得的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，1 200 r/min離心10 min；棄上清，混勻剩余液體和細(xì)胞，加入3 mL紅細(xì)胞裂解液，置于冰上15 min；然后再加入10 mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，1 200 r/min離心10 min，棄上清，混勻剩余液體和細(xì)胞后，然后加入PBS緩沖液于200目篩網(wǎng)再次過濾，重復(fù)洗滌2次，將細(xì)胞液收集于新的15 mL離心管中，即得到肝臟組織單細(xì)胞懸液。

3.7CD4+T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子檢測 取制備好的待測肝臟組織單細(xì)胞懸液(106～107個)，用100 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至專用流式管中，分別加入流式抗體，抗小鼠CD4-PE 1 μL；冰上避光孵育30 min；然后用PBS緩沖液洗滌2遍，1 200 r/min離心10 min；棄上清，分別加入100 μL的IC fixation buffer Permeabilization buffer，冰上避光孵育40 min，PBS緩沖液洗滌1遍，1 200 r/min離心10 min，棄去上清，每管分別加入IFN-γ-PC5.5、IL-4-APC混勻，置于冰上避光孵育30 min，然后用PBS緩沖液洗滌2遍，1 200 r/min離心10 min；棄上清，加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。

4統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用兩獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1ALI模型小鼠的肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

與WT組相比，ConA誘導(dǎo)的miR-7KD小鼠肝臟組織顏色變淺；同時，miR-7KD小鼠肝臟重量降低(P<0.01)，重量指數(shù)則增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The morphological changes of WT mice and miR-7KD mice with acute liver injury. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖1急性肝損傷模型下WT與miR-7KD小鼠的肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

2ALI模型小鼠肝臟組織病理學(xué)變化

與WT組小鼠相比，HE染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)的ConA miR-7KD小鼠肝臟炎性細(xì)胞浸潤增加，見圖2。

Figure 2. The pathological change in the liver tissues was observed by HE staining. The white arrowheads indicated the areas of the degenerating cells.

圖2肝臟組織的病理學(xué)變化

3ALI模型小鼠血清中ALT水平的變化

與WT小鼠相比，生化指標(biāo)檢測顯示miR-7敲減后，ConA誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT 水平顯著上升(P<0.05)，見圖3。

4ALI模型小鼠血清中細(xì)胞因子水平的變化

與WT小鼠相比，ELISA法檢測顯示ConA誘導(dǎo)的miR-7KD小鼠血清中IL-4水平明顯降低(P<0.01)， IFN-γ水平則明顯升高 (P<0.01)，見圖4。

5ALI模型小鼠肝臟中CD4+T細(xì)胞比例的變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，miR-7敲減后，ConA誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織中CD4+T細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)，見圖5。

Figure 3. The levels of ALT in the serum. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsWT group.

圖3血清中ALT的水平變化

Figure 4. The levels of IFN-γ and IL-4 in the serum. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖4血清中IFN-γ和IL-4的水平變化

Figure 5. The effect of miR-7 knockdown on CD4+T cell ratio in the liver in acute liver injury model mice. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group.

圖5miR-7敲減對ALI模型小鼠肝臟中CD4+T細(xì)胞比例的影響

6ALI模型小鼠肝臟中CD4+T細(xì)胞相關(guān)INF-γ和IL-4比例的變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，miR-7敲減后，ConA誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織中CD4+T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ的比例則顯著增加(P<0.01)，IL-4表達(dá)水平的變化差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖6。

Figure 6. The effects of miR-7 knockdown on CD4+T cell-associated cytokines expression in the liver in acute liver injury model mice. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs WT group.

圖6miR-7敲減對ALI模型小鼠肝組織中CD4+T細(xì)胞相關(guān)INF-γ、IL-4表達(dá)的影響

討 論

miRNA作為一段內(nèi)源性、長18～25個核苷酸序列的非編碼RNA分子，在基因的轉(zhuǎn)錄和mRNA的降解過程中起重要的負(fù)性調(diào)控作用。大量研究顯示改變特定miRNA的表達(dá)水平可顯著調(diào)節(jié)肝臟組織損傷的病理生理進(jìn)程[10-12]。如，Su[13]等研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miRNA-674-5p/5-LO的表達(dá)水平可顯著上調(diào)細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的水平從而加重ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷的損傷狀態(tài)；Yang 等[14]也發(fā)現(xiàn)microRNA-125b-5p作為肝細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)子，其水平的增加可顯著減輕藥物作用的細(xì)胞毒性，減輕急性肝損傷。以上數(shù)據(jù)提示，微小RNA在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，因此，深入探討特定miRNA對急性肝損傷病理發(fā)生過程的調(diào)節(jié)及相關(guān)分子作用機(jī)制不僅有助于加深對急性肝損傷的認(rèn)識，還對后續(xù)的急性肝損傷臨床診斷治療具有積極的意義。miR-7作為miRNA家族成員之一，在包括肝臟等的多個組織、器官及細(xì)胞中表達(dá)，且與組織器官的發(fā)育、分化及損傷修復(fù)密切聯(lián)系[15]。我們前期也發(fā)現(xiàn)，miR-7對急性肺損傷具有重要的調(diào)節(jié)作用[16]。新近一些研究報道m(xù)iR-7可能是肝臟相關(guān)疾病如肝癌等發(fā)生的重要調(diào)控分子[17-18]，然而miR-7與肝臟組織損傷之間的關(guān)系至今未有報道。在本研究中，我們利用前期構(gòu)建的miR-7KD小鼠模型，首次通過ConA誘導(dǎo)小鼠急性免疫性肝損傷模型，觀察miR-7敲減對該模型的影響。觀察發(fā)現(xiàn)miR-7敲減后，小鼠肝臟組織的重量顯著減輕，重量指數(shù)明顯增加；HE染色顯示miR-7敲減后肝臟組織炎性細(xì)胞浸潤明顯增多；血清中ALT的水平也明顯升高； 同時我們使用ELISA法檢測也發(fā)現(xiàn)血清中細(xì)胞因子IFN-γ的水平明顯升高，而IL-4的水平則顯著下降；以上結(jié)果顯示miR-7敲減可明顯加重ALI的病理損傷。

現(xiàn)已知，CD4+T細(xì)胞的生物學(xué)功能與急性肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)。如，Zheng 等[19]曾報道ALI患者的CD4+T細(xì)胞分泌的IFN-γ水平升高，可加重急性肝損傷的發(fā)病過程；Dong 等[20]也發(fā)現(xiàn)，在ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷中，由于細(xì)胞膜上鞘磷脂缺乏可導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞功能的降低，且因此減緩了急性肝損傷的發(fā)展進(jìn)程。更為重要的是，我們前期通過體外ConA誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-7缺乏時，CD4+T細(xì)胞的活化、增殖能力明顯增強(qiáng)，提示miR-7在CD4+T細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)功能中具有重要的調(diào)控作用[21]。然而，miR-7敲減后致使ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型的病理損傷加重，是否由CD4+T細(xì)胞參與介導(dǎo)仍不清楚。因此，在本研究中我們進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠比較，miR-7敲減后，急性肝損傷小鼠的肝臟組織中CD4+T細(xì)胞的比例明顯增加，重要的是，這些CD4+T細(xì)胞明顯高表達(dá)細(xì)胞因子IFN-γ，由此顯示miR-7敲減加重急性肝損傷的病理發(fā)生進(jìn)程極可能是由于CD4+T細(xì)胞的活化等相關(guān)功能改變所致，然而CD4+T細(xì)胞在miR-7作用的急性肝損傷的病理發(fā)生過程中的具體角色及明確的相關(guān)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

綜上數(shù)據(jù)顯示，miR-7敲減促進(jìn)了急性肝損傷的發(fā)展進(jìn)程，與CD4+T細(xì)胞的功能變化密切相關(guān)，此研究為后續(xù)急性肝損傷和基于miR-7相關(guān)炎性損傷的臨床診斷治療新策略的開發(fā)提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effect of microRNA-7 knockdown on ConA-induced acute liver injury in mice

YUE Dong-xu1, 2, ZHAO Juan-juan1, 2, ZHANG Yi-xiong1, 2, DING Tao1, 2, CHEN Hui-zi1, 2, XU Lin1, 2

(1Department of Immunology, Talent Base of Biological Therapy of Guizhou Province，2Guizhou Provincial College-based Key Laboratory for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, China. E-mail: xulinzhouya@163.com)

AIM: To study the effect of microRNA-7 (miR-7) knockdown (KD) on concanavalin A (ConA)-induced acute liver injury (ALI) in mice.METHODS: Wild type (WT) mice and miR-7KD mice were

ConA (30 mg/kg) to induced acute liver injury model by intraperitoneal injection， and the morphological changes, liver weight and weight index were measured 48 h later. The pathological changes of the liver tissues were observed by HE staining. The levels of serum alanine aminotransferase (ALT), IL-4 and IFN-γ were detected by ELISA. The proportional changes of CD4+T cells and the relative levels of IL-4 and IFN-γ were analyzed by flow cytometry.RESULTS: The color of the liver tissue became lighter, and the weight and weight index were changed significantly in miR-7KD mice compared with control group (P<0.05). HE staining showed that the inflammatory cell infiltration was increased in the liver of miR-7KD mice. Moreover, the level of serum ALT was significantly increased (P<0.05). The serum level of IFN-γ elevated significantly (P<0.01)， while the IL-4 levels decreased significantly (P<0.01) in the serum of miR-7KD mice. Furthermore, the proportion of CD4+T cells and relative IFN-γ cells increased obviously (P<0.01).CONCLUSION: miR-7 knockdown promotes the pathogenesis of the ConA-induced acute liver injury in mice.

MicroRNA-7; Acute liver injury; CD4+T cells

1000- 4718(2017)09- 1643- 05

2017- 03- 15 [

] 2017- 04- 27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 31370918)；貴州省高層次創(chuàng)新人才計劃(黔科合人才(2016)4031號)；遵義醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀青年人才計劃項目(No. 15ZY-001)

R363； R575

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.018

△通訊作者 Tel: 0851-28609530; E-mail： xulinzhouya@163.com