李春雨， 王 琪， 申 珅， 李國(guó)霞

(1天津醫(yī)科大學(xué)國(guó)際醫(yī)學(xué)院，天津 300070； 2同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院腫瘤科，上海 200433)

木犀草素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株侵襲、遷移和黏附能力的影響*

李春雨1△， 王 琪2， 申 珅1， 李國(guó)霞1

(1天津醫(yī)科大學(xué)國(guó)際醫(yī)學(xué)院，天津 300070；2同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院腫瘤科，上海 200433)

目的： 探討木犀草素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株侵襲、遷移和黏附能力的影響及其作用機(jī)制。方法: 采用不同濃度木犀草素處理體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞株，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，黏附實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞的黏附能力，Western blot檢測(cè)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snai1蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 木犀草素可明顯降低肝癌HepG2細(xì)胞的體外侵襲、遷移及黏附能力(P<0.01)，且在一定濃度范圍內(nèi)呈明顯量效關(guān)系。木犀草素處理肝癌細(xì)胞后，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin和vimentin以及轉(zhuǎn)錄因子Snai1表達(dá)均明顯下調(diào)，木犀草素對(duì)以上蛋白的調(diào)節(jié)呈明顯濃度依賴性。結(jié)論: 木犀草素體外具有抑制肝癌HepG2細(xì)胞株侵襲、遷移和黏附的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

木犀草素； 肝細(xì)胞肝癌； 細(xì)胞侵襲； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞黏附； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 [

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡(jiǎn)稱肝癌，居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位，死亡率第3位[1]。我國(guó)是肝癌大國(guó)，全世界一半以上的肝癌發(fā)生在我國(guó)，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類生命健康[2]。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者不能長(zhǎng)期生存和臨床治療失敗的主要原因[3]，因此研發(fā)低毒、高效的抗肝癌轉(zhuǎn)移藥物迫在眉睫。木犀草素(luteolin)是一種天然的多酚類黃酮化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[4]。研究報(bào)道，木犀草素對(duì)乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用[5-6]。但關(guān)于木犀草素對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移及黏附的作用研究較少，本文就此開展研究，探討木犀草素對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移和黏附的及作用機(jī)制，以期為新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1材料及儀器

CO2培養(yǎng)箱(SANYO)；IX71型倒置顯微鏡(OLYMPUS)；G:BOX F3凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)；HepG2細(xì)胞來源于ATCC，由本實(shí)驗(yàn)室保存；木犀草素購(gòu)自方舟生物試劑有限公司(純度≥98%)；Matrigel基質(zhì)膠(BD)；纖維連接蛋白(fibronectin, FN)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)購(gòu)自Sigma；抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snai1抗體購(gòu)自Abcam；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、Western blot檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光底物等購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2方法

2.1Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的侵襲能力 Matrigel用PBS稀釋成1 g/L，以每孔50 μL鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜，Transwell下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(每孔600 μL)，上室加入HepG2細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5×108/L，每孔50 μL；實(shí)驗(yàn)設(shè)木犀草素低、中、高劑量組及對(duì)照(control)組，分組后分別加入不同濃度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，37 ℃孵育24 h后，棄上室液體，棉簽擦去上膜未穿膜細(xì)胞，蘇木精染色，倒置顯微鏡計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，每張膜隨機(jī)選取3個(gè)視野，分析細(xì)胞侵襲能力變化。

2.2劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×108/L，鋪于35 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h，設(shè)木犀草素低、中、高劑量及DMSO對(duì)照(control)組，分組后加入不同濃度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO進(jìn)行處理，24 h后用10 μL槍頭在培養(yǎng)皿底部中央劃出均勻劃痕，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于不同時(shí)間(0、3、6、9、12、24 h)在倒置顯微鏡下拍照，記錄劃痕寬度變化，分析細(xì)胞遷移能力變化。

2.3黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的黏附能力 蓋玻片用10 mg/L FN包被，4 ℃過夜，風(fēng)干后置于35 mm培養(yǎng)皿中；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×108/L，加入35 mm培養(yǎng)皿中(每皿1.5 mL)，設(shè)木犀草素低、中、高劑量及對(duì)照(control)組，加入不同濃度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO處理，37 ℃孵育24 h后，加入表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(10 μg/L，每皿200 μL)或無血清培養(yǎng)基后，分別在5、15、30 min時(shí)，使用冰PBS清洗終止反應(yīng)，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，倒置顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞黏附數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，分析細(xì)胞黏附能力變化。

2.4Western blot 檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、vi-mentin和Snai1蛋白的表達(dá) 采用TGF-β1(20 μg/L)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，胰酶消化收集經(jīng)不同濃度的(10、20、40 μmol/L)木犀草素和TGF-β1處理48 h的細(xì)胞，SDS細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別加入鼠抗人E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Snai1及β-actin抗體，室溫孵育2 h，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析并對(duì)凝膠條帶信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1木犀草素對(duì)HepG2細(xì)胞體外侵襲能力的影響

本研究在Transwell小室的上室加入Matrigel，旨在模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)周圍環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)，考察木犀草素對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響[7]。結(jié)果顯示，不同濃度(10、20、40 μmol/L)木犀草素處理HepG2細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞的侵襲能力明顯下降(P<0.01)，呈明顯量效關(guān)系，見圖1。

2木犀草素對(duì)HepG2細(xì)胞體外遷移能力的影響

劃痕24后與對(duì)照組比較，不同濃度木犀草素處理的HepG2細(xì)胞劃痕距離明顯大于對(duì)照組(P<0.01)，提示木犀草素可明顯抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力，且呈明顯的量效關(guān)系，見圖2。

3木犀草素對(duì)HepG2細(xì)胞體外黏附能力的影響

不同濃度木犀草素處理HepG2細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞的體外黏附能力明顯下降(P<0.01)。木犀草素顯示出良好的抗肝癌細(xì)胞黏附的作用，且呈明顯的量效關(guān)系，見圖3。

Figure 1. Luteolin inhibited the invasion ability of HepG2 cells. A: microscopic pictures of HepG2 cells treated with luteolin for 24 h (×200); B: Transwell assay results in the HepG2 cells treated with luteolin for 24 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1木犀草素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞體外侵襲能力的影響

Figure 2. Luteolin inhibited the migration ability of HepG2 cells. A: microscopic pictures of the HepG2 cells treated with luteolin for 0 h and 24 h (×100); B: wound healing assay results in the HepG2 cells treated with luteolin at various concentrations for 0 h and 24 h. The migration distance was measured using a software-based method. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2木犀草素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞體外遷移能力的影響

Figure 3. Luteolin inhibited the adhesion ability of HepG2 cells. Adhesion assay result in HepG2 cells at 5, 15 and 30 min after treatment was showed. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3木犀草素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞體外黏附能力的影響

4木犀草素對(duì)HepG2細(xì)胞E-cadherin、N-cadhe-rin、vimentin和Snai1蛋白表達(dá)的影響

不同濃度木犀草素處理人肝癌HepG2細(xì)胞后，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，間充質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin和vimentin表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，轉(zhuǎn)錄因子Snai1水平亦明顯下調(diào)(P<0.05)，且木犀草素對(duì)以上蛋白的調(diào)節(jié)均呈濃度依賴性，見圖4。

Figure 4. Luteolin influenced the protein expression of E-cadhe-rin, N-cadherin, vimentin and Snai1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsTGF-β1 group.

圖4木犀草素對(duì)E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snai1蛋白表達(dá)的影響

討 論

HCC是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，近年來我國(guó)HCC的發(fā)病率和死亡率呈不斷攀升的趨勢(shì)。侵襲與轉(zhuǎn)移是治療臨床肝癌治療失敗和病人死亡的主要原因，也是腫瘤治療中最為棘手的問題[8]。目前尚缺乏有效的診治手段，主要還是依靠手術(shù)、化療、放療、分子靶向以及免疫治療等方法。分子靶向和免疫治療是近年來肝癌治療上的重大突破，但因價(jià)格昂貴、療效不穩(wěn)、存在耐藥現(xiàn)象等而限制了其臨床應(yīng)用[9]。因此，迫切需要尋求行之有效的治療手段。

近年研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-me-senchymal transition，EMT)在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要啟動(dòng)步驟[10]，提示逆轉(zhuǎn)EMT可能是抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要方法。EMT是指上皮來源的癌細(xì)胞在多重信號(hào)誘導(dǎo)后，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，使上皮樣連接蛋白逐漸丟失，癌細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型的過程，癌細(xì)胞由該過程增強(qiáng)遷移和侵襲能力，最終能夠侵入細(xì)胞周圍基質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)移[11]。其中上皮細(xì)胞標(biāo)志物包括E-cadherin、角蛋白(cytokeratins)等，間充質(zhì)標(biāo)志物包括N-cadherin、vimentin、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等[12]。此外，某些EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snai1、Slug和Twist等可通過抑制E-cadherin表達(dá)同時(shí)促進(jìn)N-cadherin表達(dá)，參與EMT發(fā)生。其中Snai1是首個(gè)發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子，通過表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)EMT相關(guān)標(biāo)志物基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的侵襲和遷移。Snai1高表達(dá)于肝癌、乳腺癌和胃癌等癌細(xì)胞，與腫瘤組織學(xué)分級(jí)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TGF-β被認(rèn)為是幾乎所有上皮細(xì)胞發(fā)生EMT必不可少的誘導(dǎo)因子[13]。TGF-β能夠通過Smads依賴性信號(hào)通路或非Smads依賴性信號(hào)通路調(diào)控EMT[14]。目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏臨床確切有效的EMT逆轉(zhuǎn)藥物。

課題組前期采用CCK-8法，考察了木犀草素對(duì)人肝癌的毒性作用，木犀草素對(duì)HepG2細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentration，IC50)為82.7 μmol/L。本研究所采用木犀草素的10、20、40 μmol/L 3個(gè)濃度對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率均小于10%，可視為無明顯細(xì)胞毒性，從而排除了細(xì)胞增殖對(duì)癌細(xì)胞侵襲、遷移及黏附的影響。本研究首先采用木犀草素處理人肝癌HepG2細(xì)胞，考察木犀草素體外對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移及黏附能力的影響。結(jié)果顯示，木犀草素可明顯降低HepG2細(xì)胞的體外侵襲、遷移及黏附能力，且在一定濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系。EMT為腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要啟動(dòng)步驟，TGF-β信號(hào)通路為調(diào)控肝癌EMT發(fā)生的關(guān)鍵信號(hào)通路。本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT，經(jīng)不同濃度木犀草素處理后，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin和vimentin表達(dá)明顯下調(diào)，EMT調(diào)控的關(guān)鍵因子Snai1亦明顯下調(diào)，與本研究體外肝癌細(xì)胞遷移、侵襲及黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。提示木犀草素可能通過調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT，發(fā)揮抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。本研究為木犀草素防治HCC侵襲和轉(zhuǎn)移提供了數(shù)據(jù)支持，為新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] Mazzoccoli G, Miele L, Oben J, et al. Biology， epidemiology, clinical aspects of hepatocellular carcinoma and the role of sorafenib[J]. Curr Drug Targets, 2016, 17(7):783-799.

[2] 呂桂帥， 陳 磊， 王紅陽(yáng). 我國(guó)肝癌研究的現(xiàn)狀與前景[J]. 生命科學(xué), 2015, 1(3):237-248.

[3] Suh SW, Choi YS. Predictors of micrometastases in patients with barcelona clinic liver cancer classification b hepatocellular carcinoma[J]. Yonsei Med J, 2017, 58(4):737-742.

[4] Zhang Q, Yang J, Wang J. Modulatory effect of luteolin on redox homeostasis and inflammatory cytokines in a mouse model of liver cancer[J]. Oncol Lett, 2016, 12(6):4767-4772.

[5] 肖大凱， 覃燕梅， 莫麗兒， 等. 木犀草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力的影響[J].中國(guó)病理生理雜志, 2006, 22(6):1199-1202.

[6] 王月華， 李愛峰， 付崇羅， 等. 木犀草素抗腫瘤活性研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2016, 27(7):1587-1590.

[7] Cook MT, Liang Y, Besch-Williford C, et al. Luteolin inhibits lung metastasis, cell migration, and viability of triple-negative breast cancer cells[J]. Breast Cancer (Dove Med Press), 2016,9:9-19.

[8] Lin D, Kuang G, Wan J, et al. Luteolin suppresses the metastasis of triple-negative breast cancer by reversing epithelial-to-mesenchymal transition via downregulation of β-catenin expression[J]. Oncol Rep, 2017, 37(2):895-902.

[9] 熊銳華， 杜 鵬， 蔣敬庭. 免疫細(xì)胞治療在肝癌臨床治療中的研究進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志, 2017, 35(3):203-205.

[10] 李航宇， 李 巖， 劉 丹， 等. 細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(9):1631-1636.

[11] Ryu SH, Heo SH, Park EY, et al. Selumetinib inhibits melanoma metastasis to mouse liver via suppression of EMT-targeted genes[J]. Anticancer Res, 2017, 37(2):607-614.

[12] Ma X, Yan W, Dai Z, et al. Baicalein suppresses metastasis of breast cancer cells by inhibiting EMT via downregulation of SATB1 and Wnt/β-catenin pathway[J]. Drug Des Devel Ther, 2016, 10:1419-1441.

[13] Xu F, Zhang J, Hu G, et al. Hypoxia and TGF-β induced PLOD2 expression improve the migration and invasion of cervical cancer cells by promoting epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and focal adhesion formation[J]. Cancer Cell Int, 2017, 17(1):54.

[14] Shi S, Zhao J, Wang J, et al. HPIP silencing inhibits TGF-beta1-induced EMT in lung cancer cells[J]. Int J Mol Med, 2017, 39(2):479-483.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of luteolin on invasion, migration and adhesion of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

LI Chun-yu1, WANG Qi2, SHEN Shen1, LI Guo-xia1

(1International Medical School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China.2Oncology Department, Shanghai Pulmonary Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai 200433, China. E-mail: lichunyu@tmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of luteolin on invasion, migration and adhesion of human hepatocelluar carcinoma HepG2 cells.METHODS: HepG2 cells were cultured and treated with luteolin at 10, 20 and 40 μmol/L respectively. The invasion capability was examined by cell invasion assay. The migration ability was examined by wound healing assay. The adhesion capability was measured by adhesion assay. The protein levels of E-cadherin, N-cadherin, vimentin and Snai1 were determined by Western blot analysis.RESULTS: Luteolin inhibited the invasion, migration and adhesion ability of HepG2 cellsinvitroin a dose-dependent manner. After treatment with luteolin, the expression of E-cadherin was increased significantly and the expression of N-cadherin, vimentin and Snai1 were decreased significantly.CONCLUSION: Luteolin inhibits the invasion, migration and adhesion ability of human hepatocelluar carcinoma HepG2 cells. The mechanism may be related to the regulatory effects of luteolin on epithelial-mesenchymal transition.

Luteolin; Hepatocellular carcinoma; Cell invasion; Cell migration; Cell adhesion; Epithelial-mesenchymal transition

1000- 4718(2017)09- 1606- 05

2017- 06- 05 [

] 2017- 08- 24

中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No. 2016M591398)；天津醫(yī)科大學(xué)科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No. 2015KYZQ13)；天津醫(yī)科大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(No. 2016YD07)

] R730.23； R735.7； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.012

△通訊作者 Tel： 022-83336911; E-mail： lichunyu@tmu.edu.cn