王 哲 張 敬 陳懷安 張 潮 張曉云 劉 碩 苗文隆 李鳳歧

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,張家口075000)

TRAP1通過(guò)TGF/Smad3通路對(duì)膀胱癌的遷移和侵襲能力的影響①

王 哲 張 敬②陳懷安 張 潮 張曉云③劉 碩 苗文隆 李鳳歧

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,張家口075000)

目的：探討TRAP1蛋白對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及機(jī)制。方法：采用Western blot從膀胱癌細(xì)胞株中挑選出高表達(dá)TRAP1的細(xì)胞系BIU-87；使用TRAP1沉默慢病毒(LV3-TRAP1)沉默TRAP1，使用GFP熒光及PCR檢測(cè)LV3-TRAP1沉默效率；Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)沉默TRAP1蛋白表達(dá)后對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響；CM-H2DCFDA熒光染色細(xì)胞檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；Western blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路TGF/Smad3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：LV3-TRAP1慢病毒可以有效地抑制TRAP1蛋白的表達(dá)；沉默TRAP1蛋白的表達(dá)可以有效抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力、降低膀胱癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；同時(shí)TGF/Smad3信號(hào)通路中的TGF、Smad2及Smad3蛋白表達(dá)也相應(yīng)降低。結(jié)論：沉默TRAP1蛋白可以通過(guò)調(diào)控TGF/Smad3信號(hào)通路來(lái)抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

TRAP1；膀胱癌；TGF；Smad3；ROS

膀胱癌是全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥中心研究統(tǒng)計(jì)(International agency for reasearch on cancer，IARC)，膀胱癌在男性惡性腫瘤中排第四位，在女性惡性腫瘤中排第八位[1]。膀胱根治性切除是現(xiàn)在最主要的手術(shù)治療方案，但是浸潤(rùn)肌層的膀胱癌治療效果仍然不樂(lè)觀。隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，探討膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制頗為重要，可能為膀胱癌的診斷和治療提供一定的幫助。

TNF受體相關(guān)蛋白 1(TNF receptor-associated protein 1，TRAP1)是HSP90熱休克蛋白家族的一個(gè)成員，主要存在于真核細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞核中[2]。在大多數(shù)真核細(xì)胞生物中，超過(guò)一半的線粒體和細(xì)胞核中含有熱休克蛋白序列，盡管TRAP1和ATP水解酶的結(jié)構(gòu)類似，但是它的細(xì)胞功能和機(jī)制還不清楚[3]。 TGF/Smad信號(hào)通路是眾多TGF-β誘導(dǎo)的通路的一種，但是很多研究報(bào)道Smad3 需要細(xì)胞因子激活之后才會(huì)在細(xì)胞組織中起作用。Uemura等[4]研究發(fā)現(xiàn)Smad3和Smad2的過(guò)表達(dá)可以短暫性激活α2因子，繼而誘導(dǎo)發(fā)生DNA損傷。另外有研究發(fā)現(xiàn)。肝癌中的TGF/Smad3的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肝癌轉(zhuǎn)移侵襲能力增強(qiáng)[5]。探討TGF/Smad3通路在膀胱癌中的作用機(jī)制對(duì)于膀胱癌的診斷和治療具有重要意義本研究利用慢病毒技術(shù)沉默TRAP1蛋白的表達(dá)，觀察TRAP1的表達(dá)水平，以及膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，之后檢測(cè)沉默TRAP1后TGF/Smad3信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，探討TRAP1通過(guò)TGF/Smad3信號(hào)通路對(duì)膀胱癌的遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑 人膀胱細(xì)胞株BIU-87、T24、EJ和J82購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞研究所。細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI1640，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。TRAP1、TGF、Smad2、Smad3兔單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam(ab2721、ab31013、ab40855、ab40854)。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司。TRAP1沉默及對(duì)照慢病毒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)前一天分別接種5×103個(gè)BIU-87細(xì)胞于96孔板，使細(xì)胞融合度在20%～30%。根據(jù)吉瑪慢病毒操作手冊(cè)，以0、10、100為梯度，測(cè)出TRAP1慢病毒的適宜MOI(Multiply of Infection)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 轉(zhuǎn)染TRAP1沉默慢病毒(LV3-TRAP1)的為沉默組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(LV3-NC)慢病毒的為對(duì)照組。LV3-TRAP1組加入稀釋100倍的病毒原液10 μl，LV3-NC組加入稀釋100倍的陰性對(duì)照病毒。24 h后觀察GFP熒光表達(dá)情況，根據(jù)熒光細(xì)胞數(shù)目確定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染慢病毒TRAP1的沉默效率 首先合成PCR引物(上游5′-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3′，下游5′-GCTGTCAACATACGC-TACGTA-3′)，將反應(yīng)混合液加熱至94～98℃保持20～30 s，反應(yīng)溫度降至50～65℃時(shí)，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵。退火溫度72℃，維持20～40 s，繼續(xù)降低至68℃，PCR反應(yīng)進(jìn)行30～35個(gè)循環(huán)，68～74℃延伸 5～10 min，使DNA全部反應(yīng)完畢。通過(guò)PCR結(jié)果對(duì)慢病毒沉默效率進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測(cè)TRAP1、TGF-β和Smad3蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入loading buffer后煮沸蛋白。配制10%SDS-PAGE凝膠，每孔加入30 μg蛋白樣品。使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000 TBST稀釋一抗(抗-TRAP1，TGF-β和Smad3)，4℃過(guò)夜；加入1∶5 000 稀釋的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光，統(tǒng)計(jì)不同蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAP1的表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響 所有試劑及器材均于冰上預(yù)冷，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠 50 μl(0.2 μg/μl)，37℃孵育15 min，使膠凝固；消化、離心、計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按照2.5×104ml-1用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；按照每孔200 μl，將細(xì)胞懸液加入Transwell上室，同時(shí)在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；甲醛固定，結(jié)晶紫染色15 min，然后用棉簽輕輕擦拭內(nèi)膜上的細(xì)胞。顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)4個(gè)高倍視野(×40)下穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAP1的表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)：將BIU-87細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度生長(zhǎng)在90%時(shí)，用200 μl消毒槍頭從上而下劃線，并在顯微鏡下觀察，測(cè)量劃痕的初始距離(0 time)；在24、48、72 h后，分別測(cè)量劃痕的距離，并拍照，計(jì)算細(xì)胞的遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè) 測(cè)量細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量，細(xì)胞在氯甲基二乙酸中孵化1 h，37℃，濃度為10 μm/ml，孵化1 h后，通過(guò)免疫熒光測(cè)定VICTOR3，測(cè)定線粒體活性氧的水平。細(xì)胞活性氧用MitoSOX試劑測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1TRAP1在不同膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比T24、EJ、J82細(xì)胞株，TRAP1蛋白在BIU-87細(xì)胞株中表達(dá)最高(圖1)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取BIU-87膀胱癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

2.2轉(zhuǎn)染慢病毒TRAP1的沉默效率 LV3-TRAP轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞24 h后，GFP熒光顯微鏡下觀察顯示(圖2A)：與LV3-NC組相比，綠色熒光在LV3-TRAP1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中數(shù)量明顯增多[(84.17±11.19)% vs (15.92±5.25)%,P<0.05]。結(jié)果表明LV3-TRAP1慢病毒可以有效地整合在膀胱癌BIU-87細(xì)胞中。

PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2B)：與LV3-NC組相比，LV3-TRAP1組中TRAP1 mRNA表達(dá)水平明顯減少[(0.85±0.14) vs (0.19±0.08),P<0.05]，說(shuō)明LV3-TRAP1轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞之后可以有效地降低TRAP1mRNA的表達(dá)。

2.3沉默TRAP1后膀胱癌細(xì)胞BIU-87的遷移能力變化 細(xì)胞遷移的能力可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞遷移的距離比例來(lái)測(cè)定。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)：在熒光顯微鏡下觀察，兩組細(xì)胞任意三個(gè)部位的劃痕寬度，遷移率=[D(t=24，48，72 h)-D(t=0h)]/D(t=0h)。與LV3-NC對(duì)照組相比，LV3-TRAP1組遷移比率明顯降低，在24、48、72 h結(jié)果分別是(0.19±0.01)% vs (0.38±0.04)%,P<0.05；(0.39±0.05)% vs (0.78±0.07)%,P<0.05；(0.42±0.05)% vs (0.91±0.08)%,P<0.05。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明，敲除TRAP1的表達(dá)后可以有效抑制BIU-87細(xì)胞的遷移能力。

圖1 TRAP1在不同膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.1 Expression of TRAP1 in different bladder cancer cell linesNote: *.P<0.05.

圖2 TRAP1在膀胱癌細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)染效率Fig.2 Transfection efficiency of TRAP1 in bladder cancer cell linesNote: A.Transfection efficiency after LV3-TRAP1 transfected BIU-87 by GFP fluorescence detection;B.Expression of TRAP1 was detected by PCR.Error bars represent standard error,*.P<0.05.

2.4沉默TRAP1后膀胱癌細(xì)胞BIU-87的侵襲能力變化 細(xì)胞侵襲穿透基質(zhì)膠的能力大小可以反映細(xì)胞的侵襲能力。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)：LV3-NC組穿透過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯多于LV3-TRAP1組[(411.2±16.2)vs (83.2±3.5),P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明，沉默TRAP1可以抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞的侵襲能力。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲除TRAP1對(duì)于膀胱癌BIU-87細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Effect on migration ability of BIU-87 cells were detected by wound healing assays after silencing TRAP1Note: *.P<0.05.Error bars represent standard error.

圖4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默TRAP1對(duì)于膀胱癌BIU-87細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect on invasion ability of BIU-87 cells were detected by Transwell matrigel invasion assays after silencing TRAP1Note: *.P<0.05.Error bars represent standard error.

圖5 沉默TRAP1的表達(dá)可以抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平Fig.5 Level of ROS after silencing TRAP1 were detected by CM-H2DCFDANote: *.P<0.05.Error bars represent standard error.

圖6 沉默TRAP1的表達(dá)可以抑制TGF/Smad3信號(hào)通路蛋白的表達(dá)Fig.6 Protein level of TRAP1 after silencing TRAP1 were detected by Western blotNote: *.P<0.05.Error bars represent standard error.

2.5沉默TRAP1后細(xì)胞活性氧水平檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平可以影響細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)以及代謝水平。為了避免慢病毒綠色熒光的影響，采取siRNA轉(zhuǎn)染BIU-87后通過(guò)CM-H2DCFDA試劑檢測(cè)沉默TRAP1的膀胱癌BIU-87細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，轉(zhuǎn)染TRAP1 siRNA后CM-H2DCFDA顯示的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平降低[(19.8±2.28)% vs (77.5±3.93)%，P<0.05]，熒光強(qiáng)度變?nèi)踝C實(shí)沉默TRAP1可以通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。表明沉默TRAP1可以抑制細(xì)胞的過(guò)度增殖和代謝(圖5)。

2.6沉默TRAP1后TGF/Smad3信號(hào)通路的蛋白水平變化 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默TRAP1之后TGF/Smad3信號(hào)通路中的TGF、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)相應(yīng)降低[(18.5±1.62)% vs (82.2±2.93)%，(22.9±1.34)% vs (79.4±3.37)%，(23.8±2.66)% vs (86.2±3.87)%，P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明沉默TRAP1后膀胱癌BIU-87細(xì)胞的遷移和侵襲能力的改變可能是通過(guò)TGF/Smad3信號(hào)通路調(diào)控的(圖6)。

3 討論

TRAP1是由Felts等[6]在2000年首次發(fā)現(xiàn)的，但是詳細(xì)的分子生物學(xué)功能和機(jī)制至今都未研究清楚。TRAP1在膀胱癌，宮頸癌和腎透明細(xì)胞癌中都有表達(dá)[7]。研究報(bào)道表明，TRAP1在很多類型的腫瘤組織中存在，在正常組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)，已經(jīng)有部分學(xué)者研究證明TRAP1是一種致瘤性的因子[8]。但是也有學(xué)者表明TRAP1在正常組織和腫瘤組織中都有表達(dá)，而且TRAP1的表達(dá)和腫瘤的分級(jí)分期相關(guān)[9]。在某種意義上講，TRAP1可以阻斷ROS的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體的代謝功能，影響在腫瘤細(xì)胞中線粒體的代謝[10]。TRAP1的上述功能和作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。我們認(rèn)為這可能與膀胱癌的增殖、遷移及侵襲能力相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TRAP1蛋白表達(dá)降低，膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制率會(huì)顯著提高。表明TRAP1可能與膀胱癌的進(jìn)展相關(guān)，可以在一定程度上抑制膀胱癌的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。

TGF/Smad3信號(hào)通路在人類很多惡性腫瘤中被激活，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和子宮內(nèi)膜癌等，參與腫瘤細(xì)胞侵襲遷移等生物學(xué)行為[11-14]。所以我們實(shí)驗(yàn)旨在探討TRAP1基因調(diào)控膀胱癌BIU-87是否和TGF/Smad3信號(hào)通路相關(guān)。試驗(yàn)通過(guò)敲除TRAP1蛋白過(guò)后檢測(cè)TGF/Smad3中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平降低，表明TRAP1的表達(dá)會(huì)引起TGF/Smad3通路的蛋白表達(dá)，我們推測(cè)TRAP1可能通過(guò)調(diào)控TGF/Smad3信號(hào)通路來(lái)影響膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。而且通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性氧的水平變化發(fā)現(xiàn)，TRAP1的表達(dá)可以在一定程度上降低膀胱癌細(xì)胞的活性氧水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞代謝，影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

在過(guò)去的10年里，越來(lái)越多的研究證明TRAP1蛋白可以通過(guò)多種通路途徑參與到腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中，其多功能性很受眾多學(xué)者關(guān)注[15-17]。發(fā)現(xiàn)TRAP1在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮重要作用，在乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌中也有異常的表達(dá)[18，19]?？傊琓RAP1在腫瘤細(xì)胞中扮演的功能是關(guān)鍵又復(fù)雜的，在不同腫瘤中的作用和結(jié)果可能也存在偏差。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞BIU-87中，沉默TRAP1后可以抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移，且TGF/Smad3信號(hào)通路的關(guān)鍵因子隨著TRAP1的表達(dá)下降相應(yīng)減少，提示TRAP1可能通過(guò)TGF/Smad3調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究結(jié)果不但豐富了TRAP1在惡性腫瘤中的作用機(jī)制，而且還為以TRAP1為分子靶標(biāo)的膀胱癌治療新方法提供了新的理論依據(jù)。

[1] Witjes JA,Compérat E,Cowan NC,etal.EAU guidelines on muscle-invasive and metastatic bladder cancer:summary of the 2013 guidelines[J].Europ Urol,2014,65(4):778-792.

[2] Pridgeon JW,Olzmann JA,Chin LS,etal.PINK1 protects against oxidative stress by phosphorylating mitochondrial chaperone TRAP1[J].PLoS Biol,2007,5(7):e172.

[3] Chen SJ,Yuan W,Mori Y,etal.Stimulation of type I collagen transcription in human skin fibroblasts by TGF-β:involvement of Smad 3[J].J Invest Dermatol,2014,112(1):49-57.

[4] Uemura M,Swenson ES,Gaa MDA,etal.Smad2 and Smad3 play different roles in rat hepatic stellate cell function and α-smooth muscle actin organization[J].Mol Biol Cell,2005,16(9):4214-4224.

[5] Battaglia S,Benzoubir N,Nobilet S,etal.Liver cancer-derived hepatitis C virus core proteins shift TGF-beta responses from tumor suppression to epithelial-mesenchymal transition[J].PLoS One,2009,4(2):e4355.

[6] Felts SJ,Owen BAL,Nguyen PM,etal.The hsp90-related protein TRAP1 is a mitochondrial protein with distinct functional properties[J].J Biol Chem,2000,275(5):3305-3312.

[7] Altieri DC.Mitochondrial compartmentalized protein folding and tumor cell survival[J].Oncotarget,2011,2(4):347-351.

[8] Moreno-Sánchez R,Rodríguez-Enríquez S,Marín-Hernández A,etal.Energy metabolism in tumor cells[J].Febs J,2007,274(6):1393-1418.

[9] Hardy M,Rockenbauer A,Vásquez-Vivar J,etal.Detection,characterization,and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap[J].Chem Res Toxicol,2007,20(7):1053-1060.

[10] Voos W.Chaperone-protease networks in mitochondrial protein homeostasis[J].Biochimicaet Biophysica Acta (BBA)-Mole Cell Res,2013,1833(2):388-399.

[11] Chen CF,Chen Y,Dai K,etal.A new member of the hsp90 family of molecular chaperones interacts with the retinoblastoma protein during mitosis and after heat shock[J].Mol Cell Biol,1996,16(9):4691-4699.

[12] Caino MC,Chae YC,Vaira V,etal.Metabolic stress regulates cytoskeletal dynamics and metastasis of cancer cells[J].J Clin Invest,2013,123(7):2907-2920.

[13] Chonghaile TN,Sarosiek KA,Vo TT,etal.Pretreatment mitochondrial priming correlates with clinical response to cytotoxic chemotherapy[J].Science,2011,334(6059):1129-1133.

[14] Maddalena F,Sisinni L,Lettini G,etal.Resistance to paclitxel in breast carcinoma cells requires a quality control of mitochondrial antiapoptotic proteins by TRAP1[J].Mole Oncol,2013,7(5):895-906.

[15] Ou Y,Liu L,Xue L,etal.TRAP1 shows clinical significance and promotes cellular migration and invasion through STAT3/MMP2 pathway in human esophageal squamous cell cancer[J].J Genet Genomics,2014,41(10):529-537.

[16] Chien WL,Lee TR,Hung SY,etal.Impairment of oxidative stress-induced heme oxygenase-1 expression by the defect of Parkinson-related gene of PINK1[J].J Neurochem,2011,117(4):643-653.

[17] Leav I,Plescia J,Goel HL,etal.Cytoprotective mitochondrial chaperone TRAP-1 as a novel molecular target in localized and metastatic prostate cancer[J].Am J Pathol,2010,176(1):393-401.

[18] Hu J,Tan E Y,Campo L,etal.TRAP1 is involved in cell cycle regulated by retinoblastoma susceptibility gene (RB1) in early hypoxia and has variable expression patterns in human tumors[J].J Cancer Res Updates,2013,2(3):194-210.

[19] Aust S,Bachmayr-Heyda A,Pateisky P,etal.Role of TRAP1 and estrogen receptor alpha in patients with ovarian cancer-a study of the OVCAD consortium[J].Mol Cancer,2012,11(1):1.

[收稿2017-02-14 修回2017-04-19]

(編輯 許四平 劉格格)

EffectofTRAP1oninvasionandmigrationofhumanbladdercancerthroughTGF/Smad3signalpathway

WANGZhe,ZHANGJing,CHENHuai-An,ZHANGChao,ZHANGXiao-Yun,LIUShuo,MIAOWen-Long,LIFeng-Qi.

DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000,China

Objective:To investigate the effect and related mechanism of TRAP1 on the invasion and migration of human bladder cancer through TGF/Smad3 signal path.Methods: Selected from BIU-87 of high expression of TRAP1 in bladder cancer cell lines through Western blot techniques.TRAP1 knockdown lentivirus (LV3-TRAP1) was used to silence the expression of TRAP1.GFP fluorescene and PCR detector was used to detected the efficiency of gene silencing and the effectiveness of gene silencing;effect of TRAP1 on the invasion and migration ability of BIU-87 were detected by Transwell matrigel invasion assays and wound healing assays,CM-H2DCFDA fluorescent staining was used to deteced the cell ROS of BIU-87 with LV3-TRAP1.Detected the level of TGF/Smad3 signal protein by Western blot.Results: LV3-TRAP1 lentivirus could effectively inhibit the expression of TRAP1 compared with LV3-NC.LV3-TRAP1 lentivirus could effectively inhibit the cell RPS of BIU-87.Knockdown the expression of TRAP1 could inhibit the invasion and migration of BIU-87.Knockdown the expression of TRAP1 in BIU-87 could reduce the protein level of TGF/Smad3.Conclusion: Silencing TRAP1 could inhibit the invasion and migration of bladder cancer cell through TGF/Smad3 signal pathway.

TRAP1；Bladder cancer；TGF；Smad3；ROS

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.006

①本文受張家口市2016年度市級(jí)科技計(jì)劃自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目資助(No.1621074D)。

王 哲(1978年-),男,碩士,主治醫(yī)師,主要從事膀胱癌的基礎(chǔ)和臨床研究,E-mail：wangzhe1807@126.com。

R737.14

A

1000-484X(2017)09-1306-05

②河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,張家口075000。

③河北張家口張北縣人民醫(yī)院外科，張北076450。