齊磊，羅瓊枝，戴待，張媛

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102)

·基礎(chǔ)研究·

雪菊性狀特征與質(zhì)量相關(guān)性研究△

齊磊，羅瓊枝，戴待，張媛*

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京100102)

目的：探究雪菊性狀特征與質(zhì)量的相關(guān)性，為中草藥“辨狀論質(zhì)”理論提供論據(jù)，同時(shí)為雪菊藥材標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。方法：通過研究不同批次雪菊藥材的舌狀花性狀特征、HPLC圖相似度及奧卡寧和馬里苷兩種主要查爾酮類成分的含量測定，以探尋性狀特征與化學(xué)成分特征間的關(guān)系。結(jié)果：不同批次雪菊的舌狀花，其紅褐色部分所占比例及顏色深淺存在差異；其化學(xué)成分的HPLC圖譜雖得到較高相似度，但樣品中兩種主要成分的含量存在明顯差異，且其含量與樣品性狀特征密切相關(guān)。結(jié)論：雪菊的內(nèi)在質(zhì)量與舌狀花的性狀特征存在相關(guān)性。

雪菊；性狀；含量測定；馬里苷；相關(guān)性

雪菊為菊科金雞菊屬植物兩色金雞菊CoreopsistinctoriaNutt.的干燥頭狀花序，維吾爾語名為“古麗恰依”(Gulqai)。據(jù)《新疆植物志》記載，兩色金雞菊具有清熱解毒、化濕止痢之功效[1]。兩色金雞菊的舌狀花上半部黃色，下半部紅褐色[2]，是其與同屬近緣植物的主要區(qū)別。

雪菊中黃酮類成分含量很高[3-4]，并具有抗氧化[5-6]、抗衰老[7-8]、抗腫瘤[9-10]等藥理活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)雪菊黃酮部位具有抑制小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1的增殖分化作用[11]，是雪菊重要的活性部位，其中馬里苷、奧卡寧兩種查爾酮類成分是雪菊黃酮部位的主要成分，可以用來評價(jià)該部位的質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)收集10批雪菊藥材商品，通過研究樣品的舌狀花性狀特征、HPLC圖相似度及馬里苷與奧卡寧的含量，比較不同批次的雪菊藥材間的質(zhì)量差異，確定雪菊性狀特征與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性，為建立雪菊藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器

島津LC-20AD型高效液相分析色譜儀；MerckC-18分析型色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；KQ-500E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，功率500W)；分析天平(MettlerToledo，萬分之一，十萬分之一)；高速萬能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；40目篩；5mL離心管；DragonLab1000μL移液槍；5mL、25mL容量瓶；解剖針；玻璃培養(yǎng)皿。

1.2軟件

SAS9.4版(SASInstituteInc.，Cary，NC，USA)；中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版，國家藥典委員會(huì))

1.3試藥

乙腈(色譜純，Sigma-Alrich)；甲醇、甲酸(分析純，北京化工廠)；娃哈哈純凈水。馬里苷對照品(自制，采用面積歸一化法，純度大于97.0%)；奧卡寧對照品(自制，采用面積歸一化法，純度大于99.0%)。

市購雪菊藥材10批，編號(hào)為XJ-1～10，樣品信息見表1，由北京中醫(yī)藥大學(xué)張媛副教授鑒定均為兩色金雞菊CoreopsistinctoriaNutt.的頭狀花序，其中XJ-3、XJ-6樣品中出現(xiàn)同科植物的舌狀花。

表1 雪菊藥材樣品信息

2 方法

2.1性狀鑒別

2.1.1性狀對比 選取不同批次樣品中完整的舌狀花，用水浸泡至完全展開，取出，平鋪于培養(yǎng)皿中并展開。觀察并對比各批次樣品舌狀花的顏色特征差異，進(jìn)行量化評級(jí)。

2.1.2評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 紅褐色部分大小按紅褐色部分長度占舌狀花總長度比值計(jì)：30%～35%者為“1”；35%～40%者為“2”；40%～50%者為“3”；≥50%者為“4”。顏色深淺按照肉眼所視，紅褐色部分不明顯甚至近無者為“Ⅰ”；邊緣模糊，可以看到紅褐色者為“Ⅱ”；邊緣較模糊且呈明顯紅褐色者為“Ⅲ”；紅褐色部分邊緣清晰且有近黑色者為“Ⅳ”。樣品中含有純黃色舌狀花的，僅按有紅褐色部分舌狀花的數(shù)據(jù)計(jì)算。

2.2HPLC圖建立

2.2.1色譜條件 色譜柱：Merck C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A相)，乙腈(B相)，流動(dòng)相變化梯度(0～20min，16%～18%B；20～25min，18%～23%B；25～30min，23%～27%B；30～35min，27%～35%B；35～40min，35%～68%B；40～45min，68%～95%B)；流速：1.2mL·min-1；柱溫：40℃；檢測波長：280nm；進(jìn)樣量：5μL。

2.2.2供試品溶液制備 精密稱取過40目篩的雪菊藥材粉末0.100g，置5mL離心管中，加入2mL70%甲醇，超聲提取30min，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加70%甲醇定容，得供試品溶液。

2.2.3精密度考察 取同一樣品溶液(編號(hào)XJ-5)，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，對各色譜圖相似度進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示各圖譜間相似度≥99%，表明儀器精密度良好。

2.2.4穩(wěn)定性考察 取同一樣品溶液(編號(hào)XJ-5)，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4.5、9.5、12、36、48h時(shí)進(jìn)樣測定，對各色譜圖相似度進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示各圖譜間相似度≥98%，表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5重復(fù)性考察 取同一樣品6次(編號(hào)XJ-5)，按2.2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液6份，分別按2.2.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣檢測，對各色譜圖相似度進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示各圖譜間相似度≥99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6樣品檢測及相似度評價(jià) 使用2.2.1項(xiàng)下色譜方法對各樣品進(jìn)行檢測，得到HPLC圖。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012版對得到的10批樣品的HPLC圖進(jìn)行相似度評價(jià)。

2.3含量測定

2.3.1色譜條件 檢測波長為380nm，其他條件與2.2.1項(xiàng)下相同。

2.3.2對照品溶液制備 精密稱取馬里苷與奧卡寧對照品各5.0mg，分別置于2個(gè)5mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，定容，制成濃度為1.0mg·mL-1對照品儲(chǔ)備溶液，備用。

2.3.3供試品溶液制備 同2.2.2項(xiàng)下方法。

2.3.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取適量的兩種對照品儲(chǔ)備溶液，置5mL容量瓶中，加入70%甲醇稀釋至刻度，定容，制成馬里苷質(zhì)量濃度為0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mg·mL-1，奧卡寧質(zhì)量濃度為0.04、0.03、0.02、0.01、0.005mg·mL-1的混合對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣分析，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。結(jié)果馬里苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=6 595.96X+43.81，r=0.999 0；奧卡寧含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=23 123.05X+5.08，r=0.999 9。說明馬里苷在進(jìn)樣量0.5～4 μg、奧卡寧在進(jìn)樣量0.025～0.2 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度考察 取同一樣品溶液(編號(hào)XJ-5)，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄馬里苷與奧卡寧色譜峰峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果馬里苷峰面積RSD=0.93%、奧卡寧峰面積RSD=1.01%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 取同一樣品溶液(編號(hào)XJ-5)，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4.5、9.5、12、36、48 h時(shí)進(jìn)樣測定，計(jì)算馬里苷與奧卡寧峰面積RSD值。結(jié)果馬里苷峰面積RSD=0.84%、奧卡寧峰面積RSD=0.94%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性考察 取同一樣品6次(編號(hào)XJ-5)，按2.3.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液6份，分別按2.3.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣檢測，計(jì)算馬里苷與奧卡寧色峰面積RSD值。結(jié)果馬里苷峰面積RSD=1.22%、奧卡寧峰面積RSD=1.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知化合物含量的同一樣品9份(編號(hào)XJ-05，馬里苷含量為62.50 mg·g-1，奧卡寧含量為3.37 mg·g-1)，平均分成高、中、低3個(gè)劑量組，分別加入適量的對照品后，按2.3項(xiàng)下方法制得樣品溶液，分別按2.3.1項(xiàng)下色譜方法檢測，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 雪菊中馬里苷、奧卡寧加樣回收率試驗(yàn)

2.3.9 樣品測定 分別稱取10批雪菊藥材適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制成樣品溶液，按2.3.1項(xiàng)下方法分別檢測并計(jì)算，得到各批次樣品馬里苷與奧卡寧的含量。

2.4聚類分析

將舌狀花性狀特征、HPLC圖相似度及兩種化合物在藥材中的含量作為變量，使用SAS9.4軟件進(jìn)行聚類分析分組，通過對各組內(nèi)樣品的舌狀花性狀特征與含量的特點(diǎn)共性分析，探索雪菊舌狀花性狀與內(nèi)在成分的相關(guān)性。

3 結(jié)果

3.1性狀特征

通過測量，10批樣品的舌狀花長度均在8～16mm。通過對比發(fā)現(xiàn)，不同批次雪菊樣品的舌狀花的紅褐色部分所占比例及顏色存在差別。

各批次樣品性狀對照見圖1，評價(jià)結(jié)果見表3。

紅褐色部分平均比例(%)紅褐色部分大小評級(jí)紅褐色部分顏色評級(jí)XJ-148.43ⅠXJ-265.54ⅣXJ-361.54ⅢXJ-456.74ⅡXJ-549.23ⅡXJ-635.72ⅣXJ-731.11ⅡXJ-845.23ⅡXJ-935.42ⅡXJ-1052.84Ⅳ

3.2HPLC圖相似度評價(jià)結(jié)果

通過使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對10批樣品的HPLC圖進(jìn)行相似度評價(jià)，發(fā)現(xiàn)各樣品間HPLC圖相似度均≥0.950，說明各樣品間的成分差異較小。各樣品的HPLC圖見圖2，相似度對比見表4。

圖2 雪菊藥材HPLC圖相似度評價(jià)圖

表4 雪菊藥材HPLC圖相似度評價(jià)表

3.3含量測定結(jié)果

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對馬里苷與奧卡寧兩種化合物進(jìn)行檢測并計(jì)算，最終得到各批次樣品中兩種化合物的含量。樣品與對照品HPLC圖見圖3，含量測定結(jié)果見表5。

注：1.馬里苷；2.奧卡寧。圖3 雪菊樣品及對照品HPLC圖

編號(hào)馬里苷奧卡寧峰面積質(zhì)量分?jǐn)?shù)/mg·g-1峰面積質(zhì)量分?jǐn)?shù)/mg·g-1XJ-11788.54666.13312.4943.32XJ-23329.843124.55194.4342.05XJ-32054.59476.23268.3792.85XJ-42299.08785.48248.1272.63XJ-52090.01177.55260.2772.76XJ-61693.08762.50316.6713.37XJ-71632.84660.23214.9342.27XJ-82517.15993.75190.9312.01XJ-91891.06170.02188.6691.99XJ-103030.050113.18168.5011.77

3.4聚類分析結(jié)果

因HPLC圖譜相似度評價(jià)結(jié)果為無差異，故聚類分析的變量設(shè)置為舌狀花紅褐色部分的大小、顏色深淺及馬里苷與奧卡寧的含量。使用SAS9.4軟件進(jìn)行分析。結(jié)果XJ-2、XJ-10為第一組；XJ-3、XJ-6為第二組；XJ-7、XJ-9為第三組；XJ-1、XJ-4、XJ-5、XJ-8為第四組。聚類分析樹狀圖見圖4。

圖4 雪菊樣品的聚類分析樹狀圖

3.5結(jié)論

10批雪菊藥材的HPLC圖譜相似度均≥0.950，不同批次雪菊所含化學(xué)成分的種類具有很高的相似性。但經(jīng)含量測定發(fā)現(xiàn)，10批樣品的馬里苷與奧卡寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在60.23～124.55、1.77～3.32mg·g-1，差異較大。通過聚類分析，本實(shí)驗(yàn)將10批藥材分成4組。其中第一組樣品的馬里苷含量均大于110mg·g-1，紅褐色部分顏色評級(jí)為“Ⅳ”且占比達(dá)到50%以上；組內(nèi)XJ-2的紅褐色部分比例大于XJ-10，馬里苷含量XJ-2亦高于XJ-10。第二組的樣品中均發(fā)現(xiàn)純黃色舌狀花，含量測定結(jié)果顯示該組兩個(gè)樣品的馬里苷含量較低，分別為76.23、62.50mg·g-1。第三組樣品紅色部分面積均在40%以下且顏色評級(jí)為“Ⅰ”～“Ⅱ”，馬里苷含量較低，分別為60.23、70.02mg·g-1以下。第四組樣品的紅褐色部分所占比例均在45%以上，顏色評級(jí)除XJ-1為“Ⅰ”，其他樣品均為“Ⅱ”；馬里苷含量以XJ-1的66.13mg·g-1最低，其他3個(gè)樣品中馬里苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為77.55、85.48、93.75mg·g-1。綜上所述可以發(fā)現(xiàn)，雪菊藥材的舌狀花的紅褐色部分比例越大，顏色越深，馬里苷含量越高，反之則馬里苷含量越低；純黃色舌狀花的出現(xiàn)會(huì)降低樣品中馬里苷含量。這說明雪菊舌狀花紅褐色部分的大小、顏色深淺與馬里苷含量間存在正相關(guān)，可通過雪菊舌狀花的性狀特征初步判斷雪菊中的馬里苷含量的高低。

4 討論

4.1馬里苷作為指標(biāo)成分的探討

由本實(shí)驗(yàn)可知，馬里苷是雪菊中的主要成分之一，含量較高，有研究表明馬里苷具有良好的降脂[11-12]、抗氧化活性[13]，可以作為雪菊質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)成分。

4.2純黃色舌狀花對雪菊藥材質(zhì)量的影響

據(jù)《中國植物志》記載，雪菊舌狀花下部為紅褐色[2]，約占舌狀花的1/3，可以作為雪菊真?zhèn)舞b別的重要特征。本實(shí)驗(yàn)收集的部分樣品中出現(xiàn)純黃色舌狀花，與雪菊性狀特征不符，且馬里苷含量均較低，說明黃色舌狀花的存在直接影響樣品的質(zhì)量，至于所摻入的黃色舌狀花的來源有待進(jìn)一步的研究。

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StudyonCorrelationbetweenMacroscopicPropertiesandQualitiesofHeadInflorescencesofCoreopsistinctoria

QI Lei，LUO Qiongzhi，DAI Dai，ZHANG Yuan*

(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

Objective：To study the qualities of the head inflorescences ofCoreopsistinctoriaand find the correlation between macroscopic properties and qualities to demonstrate the theories of “assessing the quality by distinguishing features of traditional Chinese medicinal materials”.Methods：The macroscopic properties of head inflorescences and the similarity of HPLC chromatograms of different batchesC.tinctoriawere examined，and contents of marein and okanin were determined.Results：There existed differences in proportion and color depth of different batches of “samples’ ligulate” flowers reddish-brown part，the similarity of HPLC chromatograms was high，but contents of marein and okanin were significantly different. The proportion and color of reddish-brown part of ligulate flower were related to the contents of marein and okanin significantly.Conclusion：The quality of the head inflorescences ofC.tinctoriais directly related to the character of the ligulate flower.

The head inflorescences ofCoreopsistinctoria;feature;determination of content; marein; correlation

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81202999)

] 張媛，副教授，研究方向：中藥與民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；E-mail：zhy0723@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.015

2017-03-26)

*[