招嘉文，祝清燦，魏俊校，黃炳森，劉凱，陳泳惠，杜藹媚

[1.國(guó)藥集團(tuán)德眾(佛山)藥業(yè)有限公司，廣東 佛山 528000；2.國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550200]

·中藥工業(yè)·

藏藥十味乳香膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

招嘉文1，祝清燦2*，魏俊校1，黃炳森1，劉凱2，陳泳惠1，杜藹媚1

[1.國(guó)藥集團(tuán)德眾(佛山)藥業(yè)有限公司，廣東 佛山 528000；2.國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550200]

目的：提高十味乳香膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)處方中訶子和毛訶子進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定大黃酚的含量，使用FNG Redclassical C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)為流動(dòng)相；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果：薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾。大黃酚在0.100 8～1.008 μg有良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)，平均加樣回收率為99.02%(n=6)，RSD為1.91%。結(jié)論：建立的方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

十味乳香膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法；訶子；毛訶子；大黃酚

十味乳香膠囊為藏藥制劑，由寬筋藤、訶子、毛訶子、決明子、黃葵子、乳香等組成。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》腦系經(jīng)絡(luò)肢體分冊(cè)。具有祛風(fēng)燥濕的功能。用于濕疹、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等風(fēng)濕痹癥、黃水病、皮膚病。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)寬筋藤、木香進(jìn)行薄層色譜法鑒別，采用薄層掃描法進(jìn)行決明子中大黃酚的含量測(cè)定。為了控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)訶子[1-6]、毛訶子進(jìn)行定性鑒別[1，5-6]，改用高效液相色譜法對(duì)大黃酚進(jìn)行含量測(cè)定[1，8]，為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器

Waters2695高效液相色譜儀(在線脫氣機(jī)、四元泵、2998PDA二極管陣列檢測(cè)器、Empower2化學(xué)工作站)；BS224S電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；YOKO-ZS薄層色譜成像儀(武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；ZF-2C型暗箱式自動(dòng)紫外分析儀(上海安亭電子儀器廠)；必能信超聲波清洗儀[型號(hào)Branson5510，必能信超聲(上海)有限公司]；功率250W，頻率40kHz)。

1.2試藥

HPLC用甲醇為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：144639)；水為超純水；其余試劑為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

訶子對(duì)照藥材(121015-201004)、毛訶子對(duì)照藥材(121206-0101)、大黃酚對(duì)照品(110796-201118)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠G預(yù)制薄層板(德國(guó)默克公司，批號(hào)：HX377558)；硅膠G預(yù)制薄層板(青島海洋化工廠分廠，批號(hào)：20120622)；硅膠G預(yù)制薄層板(浙江臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)；硅膠G(200目，青島海洋化工有限公司分，批號(hào)：0130616)。C18固相萃取小柱(WatersSep-PakVac500mg/3cc，沃特世公司，批號(hào)：036032328A；VarianBondElute-C18500mg/3mL，瓦里安公司，批號(hào)：0703510；WelchC18E500mg/6mL，月旭科技公司，批號(hào)：00501)。

十味乳香膠囊樣品(青海普蘭特藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為140201，140504，140613，140701，140711，140811，140907，141003，141116，150130)。

2 方法與結(jié)果

2.1訶子薄層色譜鑒別

2.1.1供試品溶液的制備 取十味乳香膠囊內(nèi)容物1g，加無(wú)水乙醇30mL，加熱回流30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)眉状?mL使溶解，通過(guò)中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內(nèi)徑為2cm)，用稀乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解，濾過(guò)，濾液通過(guò)已處理好的C18固相萃取小柱(規(guī)格500mg，3mL，先用甲醇10mL沖洗，再用水10mL沖洗)，用30%甲醇10mL洗脫，棄去30%甲醇洗脫液，再用甲醇10mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?.5mL使溶解，作為供試品溶液[1]。

2.1.2對(duì)照藥材溶液的制備 取訶子對(duì)照藥材0.5g，加無(wú)水乙醇30mL，按2.1.1方法制備，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3陰性對(duì)照溶液的制備 按照處方配比，取除訶子外的其他藥味，按十味乳香膠囊工藝制成樣品，按2.1.1的方法制成缺訶子陰性對(duì)照溶液。

2.1.4薄層鑒別方法及結(jié)果 吸取供試品溶液與缺訶子陰性對(duì)照溶液各10μL、訶子對(duì)照藥材溶液5μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(15∶5∶2)10℃以下放置過(guò)夜的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

注：1～3.供試品(批號(hào)：140504，140613，140701)；4.訶子對(duì)照藥材；5.缺訶子陰性。圖1 十味乳香膠囊訶子薄層色譜圖

2.2毛訶子薄層色譜鑒別

2.2.1供試品溶液的制備 取十味乳香膠囊內(nèi)容物1g，加無(wú)水乙醇30mL，加熱回流30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)眉状?mL使溶解，通過(guò)中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內(nèi)徑為2cm)，用稀乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解，濾過(guò)，濾液通過(guò)已處理好的C18固相萃取小柱(規(guī)格500mg，3mL，先用甲醇10mL沖洗，再用10mL水沖洗)，用30%甲醇10mL洗脫，棄去30%甲醇洗脫液，再用10mL甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?.5mL甲醇使溶解，作為供試品溶液[1]。

2.2.2對(duì)照藥材溶液的制備 取毛訶子對(duì)照藥材0.5g，加無(wú)水乙醇30mL，按2.1.1方法制備，殘?jiān)?mL甲醇使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按照處方配比，取除毛訶子外的其他藥味，按十味乳香膠囊工藝制成樣品，按2.2.1方法制成缺毛訶子陰性對(duì)照溶液。

2.2.4薄層鑒別方法及結(jié)果 吸取供試品溶液與缺毛訶子陰性對(duì)照溶液各10μL、毛訶子對(duì)照藥材溶液5μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置于紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照在相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

注：1～3.供試品(批號(hào)：140504，140613，140701)；4.毛訶子對(duì)照藥材；5 缺毛訶子陰性。圖2 十味乳香膠囊毛訶子薄層色譜圖

2.3大黃酚的含量測(cè)定

2.3.1供試品溶液的制備 取十味乳香膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，80℃水浴回流30min，濾過(guò)，濾渣用10mL甲醇洗滌，合并濾液，蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，再加鹽酸1mL，置水浴中加熱30min，立即冷卻，用乙醚振搖提取4次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為50μg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.3陰性對(duì)照溶液的制備 按照處方配比，取除決明子外的其他藥味，按十味乳香膠囊工藝制成樣品，按2.3.1方法制成缺決明子陰性對(duì)照溶液。2.3.4色譜條件 采用FNGRedclassicalC18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱、Kromasil5-100C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱和WelchUltimateXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)為流動(dòng)相，流速1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；理論板數(shù)按大黃酚峰計(jì)不低于3000，分離度大于1.5，符合規(guī)定。

2.3.5專屬性試驗(yàn) 吸取大黃酚對(duì)照品溶液、十味乳香膠囊供試品溶液、缺決明子陰性對(duì)照溶液各5μL，按2.3.4色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，大黃酚能與其他成分的色譜峰分離，缺決明子陰性對(duì)照無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：A.大黃酚對(duì)照品；B.十味乳香膠囊樣品；C.缺決明子陰性對(duì)照樣品。圖3 大黃酚檢測(cè)HPLC圖

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)十味乳香膠囊供試品溶液中的大黃酚色譜峰進(jìn)行峰光譜掃描和純度檢測(cè)，結(jié)果峰純度角度<峰純度閾值，供試品中大黃酚光譜圖與譜庫(kù)中大黃酚標(biāo)準(zhǔn)光譜圖匹配理想，說(shuō)明大黃酚色譜峰為純峰，純度符合要求。見(jiàn)圖4～5。

圖4 供試品溶液大黃酚純度檢測(cè)圖

圖5 供試品溶液大黃酚光譜庫(kù)匹配圖

2.3.6線性關(guān)系的考察 取大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中含大黃酚201.6μg的對(duì)照品溶液。精密吸取該對(duì)照品溶液5mL(n=4)，分別置于10、20、25、50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成系列濃度對(duì)照品溶液Ⅰ～Ⅳ(質(zhì)量濃度分別為100.8、50.40、40.32、20.16μg·mL-1)。分別精密吸取對(duì)照品溶液、系列濃度對(duì)照品溶液Ⅰ～Ⅳ各5μL，注入液相色譜儀，按2.3.4色譜條件測(cè)定各自峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，求得大黃酚的線性回歸方程：Y=4554912X+16672，r=0.9997。結(jié)果表明，大黃酚在0.1008～1.008μg線性關(guān)系良好。

2.3.7精密度試驗(yàn) 精密吸取大黃酚對(duì)照品溶液(50.40μg·mL-1)5μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，按2.3.4色譜條件測(cè)定，平均峰面積為1183254，RSD為1.0%，符合測(cè)定要求。

2.3.8穩(wěn)定性考察 取十味乳香膠囊(批號(hào)140201)按照2.3.1方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、11、24h進(jìn)樣5μL，按2.3.4色譜條件測(cè)定，大黃酚峰面積的RSD為0.5%，結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9重復(fù)性試驗(yàn) 取十味乳香膠囊(批號(hào)140201)，研細(xì)，混勻，取6份，每份約2g，精密稱定，按2.3.1方法制備供試品溶液。按2.3.4色譜條件測(cè)定每一份的含量，結(jié)果樣品中大黃酚平均含量為0.298mg·g-1，RSD為1.4%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.10加樣回收試驗(yàn) 取十味乳香膠囊(批號(hào)：140201，含大黃酚0.298mg·g-1)，研細(xì)，混勻，取6份，每份約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液(每1mL中含大黃酚62.09μg)5mL，按2.3.1方法制備供試品溶液，按2.3.4色譜條件測(cè)定，計(jì)算大黃酚的回收率。結(jié)果平均回收率為99.02%，RSD為1.91%，表明方法的準(zhǔn)確性較好。見(jiàn)表1。

表1 大黃酚加樣回收測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.3.11 耐用性考察 取十味乳香膠囊(批號(hào)140504)，采用不同品牌的色譜柱A：Kromasil 5-100 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、B：Welch Ultimate XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、C：FNG Redclassical C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，按2.3.4 色譜條件測(cè)定，分離度分別為1.5、1.5、1.8，理論板數(shù)分別為19 127、13 960、15 288，RSD為1.4%，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)色譜條件耐用性良好。見(jiàn)圖6。

注：A：Kromasil 5-100 C18；B：Welch Ultimate XDB-C18；C：FNG Redclassical C18。圖6 不同色譜柱的比較

2.3.12 樣品的測(cè)定 取十味乳香膠囊10個(gè)批號(hào)，按2.3.1制備供試品溶液，按2.3.4色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算大黃酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 十批成品中大黃酚含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

中訶子、毛訶子為處方主要組成藥味，與功能主治有密切關(guān)系，因此增加訶子、毛訶子的鑒別有利于提高產(chǎn)品質(zhì)量控制。參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部訶子、毛訶子的薄層色譜鑒別方法，采用相同的供試品溶液提取方法分別進(jìn)行訶子和毛訶子的鑒別，參照中華人民共和國(guó)藥典的薄層色譜條件，發(fā)現(xiàn)訶子和毛訶子陰性有干擾，展開(kāi)效果不理想。故對(duì)薄層色譜條件進(jìn)行篩選優(yōu)化，最終采用本文的薄層色譜條件。結(jié)果表明，薄層色譜斑點(diǎn)清晰，方法專屬性好，陰性無(wú)干擾。

在訶子和毛訶子的鑒別研究中，曾采用不同品牌的薄層板和SPE固相萃取小柱進(jìn)行比較，并分別考察了高溫、高濕、低溫、低濕等環(huán)境對(duì)薄層展開(kāi)效果的影響，結(jié)果均能得到清晰的薄層色譜斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，說(shuō)明方法的耐用性較好。

取大黃酚對(duì)照品溶液，經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在210～400 nm進(jìn)行掃描，大黃酚在225.4、257.3、288.1 nm處有吸收峰，大黃酚在257.3 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部大黃藥材項(xiàng)下規(guī)定[1]，確定254 nm為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。

原標(biāo)準(zhǔn)采用薄層掃描法測(cè)定決明子中大黃酚的含量，受上樣技術(shù)、薄層板質(zhì)量、展開(kāi)條件、溫濕度等因素影響較大，平行實(shí)驗(yàn)的精密度較差，方法準(zhǔn)確性不夠理想。故采用HPLC法測(cè)定大黃酚的含量，提高含量測(cè)定的重現(xiàn)性和自動(dòng)化程度。經(jīng)兩種方法測(cè)得的數(shù)據(jù)比較，無(wú)顯著差異。

處方?jīng)Q明子中大黃酚的含量測(cè)定參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，比較了乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫、不同比例的甲醇-0.1%磷酸等度洗脫、不同比例的乙腈-甲醇-0.1%磷酸洗脫系統(tǒng)，最后采用甲醇-0.1%磷酸(80∶20)洗脫系統(tǒng)，具有專屬性高、重現(xiàn)性好，分離能力強(qiáng)、靈敏度高，與中華人民共和國(guó)藥典系統(tǒng)相比有操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 楊俊榮，孫芳云.訶子化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2008，20(3)：450-451.

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[6] 國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)：青鵬軟膏.藥典委網(wǎng)站公示稿.

[7] 楊希，聶晶，譚靜玲，等.一清系列制劑中大黃素和大黃酚的含量比較[J].中國(guó)藥師，2014,17(8)：1340-1352.

[8] 母小東，蘇晶，汪楊麗.HPLC測(cè)定八正片中大黃素及大黃酚含量[J].食品與藥品，2014,16(3):203.

Studies on Quality Standard of SHIWEIRUXIANG Capsule

ZHAO Jiawen1,ZHU Qingcan2,WEI Junxiao1,HUANG Bingsen1,LIU Kai2,CHEN Yonghui1,DU Aimei1

[1.Sinopharm Group Dezhong(Foshan) Pharmaceutical Co.,Ltd.,Foshan Guangdong 528000，China；2.Sinopharm Group Tongjitang(Guizhou) Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guiyang Guizhou 550200，China]

Objective：To improve the quality standard of SHIWEIRUXIANG Capsule.Methods：The TLC method was used to qualitatively identify Fructus ofTerminaliachebulaandT.billericae.HPLC was used to determine chrysophanol.Results： Thin layer chromatograms were clear with good specificity，and no interfere was observed in negative TLC chromatogram.The calibration curve of chrysophanol was linear in the range of 0.100 8-1.008 μg (r=0.999 7).The average recovery was 99.02%，RSD was 1.91%.Conclusion: The established methods were accurate，reliable，reproducible and can be used for the quality control of SHIWEIRUXIANG Capsule.

SHIWEIRUXIANG Capsule;TLC;HPLC;Terminaliachebula;TerminaliabillericaeFructus;chrysophanol.

] 祝清燦，高級(jí)工程師，研究方向：中藥成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；E-mail：657662046@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.023

2016-02-25)

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