耿直

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046)

·中藥農(nóng)業(yè)·

秦嶺凹葉厚樸內(nèi)生真菌研究初報(bào)△

耿直*

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046)

目的：通過(guò)對(duì)凹葉厚樸內(nèi)生真菌的鑒定研究，進(jìn)一步豐富凹葉厚樸內(nèi)生真菌種群的多樣性，為更加合理有效的利用藥用植物資源提供依據(jù)。方法：本文通過(guò)微生物方法從秦嶺凹葉厚樸中分離純化內(nèi)生真菌，采用顯微形態(tài)觀察法對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果：對(duì)秦嶺凹葉厚樸內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化及初步鑒定，共分離得到內(nèi)生真菌34株，其中四川都江堰共分離14株，優(yōu)勢(shì)菌群為枝孢屬；陜西漢中共分離20株，優(yōu)勢(shì)菌群為鐮刀菌屬。初步鑒定結(jié)果為：1綱，3目，4科，9屬。其中曲霉屬3株，青霉屬1株，葡萄孢屬2株，膠帚霉屬1株，鐮刀菌屬16株，枝孢屬5株，交鏈孢屬1株，束絲核菌屬2株，組絲核菌屬3株。結(jié)論：凹葉厚樸內(nèi)生真菌的種群存在著極其豐富的多樣性特征，為合理利用凹葉厚樸藥用成分及保護(hù)凹葉厚樸藥用植物資源提供理論依據(jù)。

凹葉厚樸；內(nèi)生真菌；多樣性

凹葉厚樸為多年生禾本科植物，為木蘭科木蘭屬植物厚樸的一個(gè)亞種[1]，是我國(guó)特產(chǎn)樹種，主產(chǎn)浙江、福建、四川、湖北、湖南、江西等地，商品習(xí)稱溫樸，產(chǎn)量大[2]，是我國(guó)傳統(tǒng)的特有珍貴中藥材。凹葉厚樸其性溫，味苦、辛；具有溫中化痰引滯、下氣的功效；用于消炎滅菌、痰飲喘滿、胸腹脹滿、腸梗阻等癥[3]。其主要藥效成分是厚樸酚與和厚樸酚，兩種化合物均具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗神經(jīng)變性、抗抑郁等多種藥理活性。陜西屬于凹葉厚樸的邊緣產(chǎn)區(qū)，主要產(chǎn)于安康、漢中一帶。

在采收樹齡上，傳統(tǒng)認(rèn)為凹葉厚樸種植16年后方可采剝進(jìn)行利用，然而近年來(lái)對(duì)于厚樸及凹葉厚樸藥理活性的研究深入，藥材需求量的不斷增加，大批凹葉厚樸未到采種年齡就被提前砍伐，由于過(guò)度濫伐森林和大量剝?nèi)淦に幱?，?dǎo)致凹葉厚樸的分布范圍迅速縮小，成年野生植株極少見，已處于瀕危狀況。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，除了分離出產(chǎn)生紫杉醇內(nèi)生真菌的藥用植物外，至少有130多種的藥用植物被研究過(guò)內(nèi)生真菌[4]。通過(guò)相關(guān)查閱與調(diào)查，秦嶺地區(qū)凹葉厚樸內(nèi)生真菌研究報(bào)道較少。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 采自陜西省漢中市洋縣華陽(yáng)古鎮(zhèn)金絲猴溝和四川省都江堰的凹葉厚樸根、莖，置于無(wú)菌袋中，4℃冰箱保存。經(jīng)我院雷國(guó)蓮教授鑒定為木蘭科木蘭屬凹葉厚樸Magnoliaofficinalissubsp.biloba(Rehd.et Wils.)Cheng et Law。

1.1.2培養(yǎng)基 CPDA培養(yǎng)基；查氏培養(yǎng)基

1.1.3主要儀器 人工氣候箱(LRH-250-G-S，廣東省醫(yī)療器械廠)；雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司)等。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌分離與純化 取新鮮健康的凹葉厚樸的根、莖，根、莖截成5cm小段，刮去外表皮直至露出韌皮部即可，流動(dòng)水沖洗24h，將沖洗好的材料移入超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌水沖洗3次，75%乙醇消毒10～30s，而后用0.1%升汞漂洗(5～10min)，無(wú)菌水沖洗3次。手術(shù)刀剝下根皮，枝皮，使用手術(shù)剪剪成0.5cm×0.5cm的小塊，接入已倒好的馬鈴薯培養(yǎng)基。置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d。

取切口處新長(zhǎng)出的菌絲及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)長(zhǎng)出時(shí)間的不同、菌落形態(tài)以及顏色的差異，分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，如此反復(fù)純化多次后即可得到一個(gè)純菌株，置入4℃冰箱中保存。

1.2.2內(nèi)生真菌形態(tài)觀察 制片檢查：純培養(yǎng)物接種于CA培養(yǎng)基，28℃下倒置培養(yǎng)，待剛長(zhǎng)出菌絲時(shí)，將無(wú)菌的蓋玻片斜插入平板內(nèi)(插片法)[5]，繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲爬滿蓋玻片，將玻片取出，在顯微鏡下觀察其特征。參考真菌鑒定手冊(cè)對(duì)其分類地位進(jìn)行初步鑒定[6]。

2 結(jié)果及分析

2.1結(jié)果

從凹葉厚樸中共分離出34株內(nèi)生真菌，其中從陜西洋縣中分離得到20株內(nèi)生真菌，從四川都江堰中分離得出14株內(nèi)生真菌。結(jié)果見表1和表2，在厚樸內(nèi)生真菌中，從數(shù)量上看，以鐮刀菌屬Fusarium為優(yōu)勢(shì)種群，包含菌株占總菌株數(shù)的47%。

表1 凹葉厚樸內(nèi)生真菌的種群組成

表2 不同采集地點(diǎn)凹葉厚樸內(nèi)生真菌的數(shù)量及種類分布情況

部分屬種代表性菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征見圖1-7。

圖1 SC-2束絲核菌屬Ozonium sp.

圖2 SC-4枝孢屬Cladosporium sp.

圖3 SC-9交鏈孢屬Alternaria sp.

圖4 SC-13膠帚霉屬Gliocladium sp.

圖5 SC-14組絲核菌屬Phacodium sp.

圖6 YX-4鐮刀菌屬Fusarium sp.

圖7 YX-13葡萄孢屬Botrytis cinerea sp.

2.2結(jié)果分析

厚樸酚與和厚樸酚是從厚樸及凹葉厚樸中提取出來(lái)的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、調(diào)節(jié)腸功能和抗胃潰瘍、中樞抑制、肌肉松弛、降壓和抗聚集、提高免疫、抗過(guò)敏、抗菌、抗病毒、抗癌等多種藥理活性，現(xiàn)今臨床藥用厚樸酚主要來(lái)源于從瀕危植物厚樸及凹葉厚樸組織中提取，但已嚴(yán)重破壞自然資源，不利于厚樸資源保護(hù)。然而根據(jù)植物內(nèi)生真菌共生的內(nèi)生真菌的理論，植物內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似，具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為獲得厚樸酚這一天然產(chǎn)物開辟了一條新途徑。但由于產(chǎn)量較低，仍不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。篩選高產(chǎn)內(nèi)生真菌菌株，進(jìn)行菌種改良及工程菌株的構(gòu)建是解決目前內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)厚樸酚主要途徑。

本次實(shí)驗(yàn)材料分別采自四川都江堰和陜西漢中，共分離到34株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為1綱、3目、4科、9屬。凹葉厚樸內(nèi)生真菌的種群組成可以看出凹葉厚樸內(nèi)生真菌在種類上存在著極其豐富的多樣性特征。在凹葉厚樸內(nèi)生真菌中，從數(shù)量上可以看，以鐮刀菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，包含菌株占總菌株數(shù)的47%。

從四川都江堰和陜西漢中采集的凹葉厚樸植株中均分離到了一定數(shù)量、類群不同的內(nèi)生真菌，表明內(nèi)生真菌在凹葉厚樸中廣泛存在。不同采集地點(diǎn)的凹葉厚樸中內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌群不同。采集于四川都江堰的凹葉厚樸優(yōu)勢(shì)菌體為枝孢屬，采集于陜西漢中的優(yōu)勢(shì)菌體為鐮刀菌屬。采集于四川都江堰的凹葉厚樸植株中的內(nèi)生真菌在種類上相對(duì)于采自陜西漢中顯得豐富，認(rèn)為這與采集地的具體環(huán)境、凹葉厚樸的樹齡，以及材料采集時(shí)間有關(guān)。

在有關(guān)厚樸的研究報(bào)道中也可發(fā)現(xiàn)，不同采集地點(diǎn)的厚樸所含內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌體不同，采集于峨眉山唐山的優(yōu)勢(shì)菌體為青霉屬，采集于都江堰市虹口鄉(xiāng)的優(yōu)勢(shì)菌體為曲霉屬。采集于峨眉山的厚樸植株中的內(nèi)生真菌在種類上較之采自都江堰者顯得豐富，鐮孢屬為兩個(gè)不同來(lái)源厚樸的共有菌群[7]。

藥用植物中蘊(yùn)藏著豐富的內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌在植物中的分布受組織與年齡結(jié)構(gòu)的影響。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌在凹葉厚樸根中分布最多，共21株，莖次之，共13株。根中所含內(nèi)生真菌主要是常見的土壤和根部或由根部傳導(dǎo)的真菌，由于凹葉厚樸根處于土壤中，并通過(guò)土壤吸收植物所需養(yǎng)分，內(nèi)生真菌利用植物的營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)生長(zhǎng)繁殖，所以根中內(nèi)生真菌含量最高；而凹葉厚樸莖將根部吸收的營(yíng)養(yǎng)傳輸?shù)街参锔鞑糠?，且莖長(zhǎng)期暴露與環(huán)境之中，所以莖中內(nèi)生真菌含量低于根部?jī)?nèi)生真菌的含量。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)凹葉厚樸內(nèi)生真菌的分離及初步鑒定，對(duì)凹葉厚樸所含內(nèi)生真菌進(jìn)行了初步研究，為豐富凹葉厚樸內(nèi)生真菌種群的多樣性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為利用內(nèi)生真菌研究凹葉厚樸藥用成分提供初步基礎(chǔ)，為更加合理有效的利用藥用植物資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:235.

[2] 張貴君.現(xiàn)代中醫(yī)藥材商品通鑒[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2001：1234.

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：218.

[4] 姜威，金文藻，張?jiān)虑?，?東北紅豆杉內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)研究[J].中國(guó)抗生素雜志，1998，23(4)：263-266.

[5] 劉士旺.真菌形態(tài)的幾種觀察方法[J].生物學(xué)通報(bào)，1998，33(10)：45.

[6] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[7] 龐蕾，嚴(yán)鑄云，郭曉恒，等.厚樸內(nèi)生真菌的研究(I)：菌種分離及其鑒定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(10)：2013-2014.

Preliminary Study on Diversity of Endophytic Fungi in QinLingMagnoliaofficinalissubsp.biloba

GENG Zhi*

(Shanxi Institute of International Trade Commerce，Xi’an 712046，China)

Objective：Through the study on the endophytic fungus of theMagnoliaofficinalissubsp.biloba，in order to enrich the diversity of endophytic fungus of the Magnolia officinalis subsp.biloba，to promote the development of research on the medicinal plant resources.Methods：Isolated the endophytic fungus from QinlingM.officinalissubsp.bilobawith Microbiological methods，Take the Microscopic morphology observation to identificat.Results：34 strains of endophytic fungi were isolated from QinlingM.officinalissubsp.biloba，among them 14 strains were isolated from Dujiangyan of Sichuan，The Cladosporium is dominant bacterial community.20 strains were isolated from Hanzhong of Shaanxi，the Fusarium is dominant bacterial community.The appraisal result is：1 class 3 orders 4 families 9 genus.aspergillus is 3 strains，penicillium is 1strain，Botrytis is 2 strains，Gliocladium is 1strain，F(xiàn)usarium is 16 strains，Cladosporium is 5 strains，Alternaria is 1 strain，Rhizoctonia is 2 strains，Phacodium is 3 strains.Conclusion：The endophytic fungi ofM.officinalissubsp.bilobahave rich population diversity，Based on available for using the Component ofM.officinalissubsp.bilobaand protecting the resources ofM.officinalissubsp.biloba.

Magnoliaofficinalissubsp.biloba；Endophytic fungi；diversity

陜西省教育廳2014年科學(xué)研究計(jì)劃(專項(xiàng)項(xiàng)目)，編號(hào)：14JK2010

] 耿直，講師，研究方向：生物工程及植物生物技術(shù)研究；E-mail：gengyzx1226@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.019

2016-04-07)

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