賀 琴，王自蕊，游金明?，陳麗玲,2，盧亞飛，李蘭海

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省營(yíng)養(yǎng)飼料開發(fā)工程中心，江西南昌330045；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，江西南昌 330004）

基于MiSeq高通量測(cè)序方法研究酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

賀 琴1，王自蕊1，游金明1?，陳麗玲1,2，盧亞飛1，李蘭海1

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省營(yíng)養(yǎng)飼料開發(fā)工程中心，江西南昌330045；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，江西南昌 330004）

本試驗(yàn)旨在探討飼糧中添加酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取180頭遺傳背景相同、胎次相近、體重接近的21日齡斷奶仔豬，隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9頭豬。4個(gè)處理分別飼喂0 %酵母壁多糖飼糧（對(duì)照組）、0.15%酵母壁多糖飼糧（0.15%組）、0.30%酵母壁多糖飼糧（0.30%組）和0.45%酵母壁多糖飼糧（0.45%組）。試驗(yàn)期為21 d。取盲腸內(nèi)容物提取細(xì)菌DNA，PCR擴(kuò)增獲得16S rRNA基因V4標(biāo)簽片段，進(jìn)行MiSeq高通量測(cè)序。結(jié)果表明：當(dāng)酵母壁多糖添加量達(dá)一定程度時(shí)，仔豬盲腸菌群多樣性會(huì)發(fā)生改變；在不考慮群落中每個(gè)物種豐度的前提下，0.30%酵母壁多糖組仔豬盲腸菌群最豐富；仔豬盲腸優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、螺旋體門和變形菌門；與對(duì)照組相比，添加0.30%酵母壁多糖能降低仔豬腸道擬桿菌門含量（P＜0.05），添加0.30%或0.45%酵母壁多糖能顯著增加盲腸厚壁菌門含量（P＜0.05），添加0.45%酵母壁多糖還能提高仔豬盲腸軟壁菌門含量（P＜0.05）；酵母壁多糖具有降低盲腸變形菌門含量的趨勢(shì)（P=0.066）；普氏菌屬為仔豬盲腸優(yōu)勢(shì)菌屬，酵母壁多糖能顯著提高仔豬盲腸厭氧弧菌屬、瘤胃桿菌屬、糞球菌屬和考拉桿菌屬的含量（P＜0.05），顯著降低鏈球菌屬的含量（P＜0.05）。由此可知，當(dāng)酵母壁多糖添加量達(dá)到一定水平時(shí)，短期添加可提高斷奶仔豬盲腸厚壁菌門以及瘤胃桿菌屬和糞球菌屬等優(yōu)勢(shì)菌群的含量。

酵母壁多糖；斷奶仔豬；菌群結(jié)構(gòu)；菌群多樣性

腸道微生態(tài)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。微生物種類多達(dá)1 000～1 150種，且細(xì)菌總數(shù)是宿主細(xì)胞數(shù)量的10倍[1-2]。在正常情況下，機(jī)體胃腸道微生物處于穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。但是畜禽的日齡、遺傳背景和飼養(yǎng)環(huán)境會(huì)改變腸道菌群結(jié)構(gòu)[3]。在外界環(huán)境發(fā)生變化或飼糧改變等應(yīng)激狀態(tài)下，腸道微生物區(qū)系平衡會(huì)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致機(jī)體腸道有害菌增殖，使得宿主健康受到影響。受飼糧等因素影響，斷奶期是仔豬腸道菌群最不穩(wěn)定的時(shí)期。穩(wěn)定的腸道菌群能夠保證胃腸道正常的消化和吸收。同時(shí)，在胃腸道定植的有益菌群可以形成機(jī)體內(nèi)非特異性生物保護(hù)屏障，一定程度上可抑制病原菌定殖。因此，動(dòng)物胃腸道微生物平衡是畜禽健康生長(zhǎng)和正常生產(chǎn)的必要前提[4]。益生元是一種不可消化的飼糧添加劑，它能選擇性地刺激腸道中潛在的有益微生物，并減少病原微生物的生長(zhǎng)，從而改變腸道微生物群的組成并改善宿主健康[5-6]。早前研究發(fā)現(xiàn)，酵母壁多糖能改善斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，提高腸道揮發(fā)性脂肪酸含量，并可降低腸道大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量[7-8]。但受傳統(tǒng)微生物研究方法限制，酵母壁多糖對(duì)腸道微生物菌群影響的研究甚少。目前，核酸測(cè)序技術(shù)能夠更全面、準(zhǔn)確地反映腸道菌群的結(jié)構(gòu)與組成，因此本研究基于MiSeq高通量測(cè)序方法，測(cè)定短期飼喂酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為酵母壁多糖在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 酵母壁多糖為啤酒酵母壁多糖，來源于拓普生物科技有限公司，其主要成分為甘露寡糖（23.45%）、β-葡聚糖（39.24%）。粗蛋白質(zhì)含量為26.30%、粗灰分含量為3.30%、水分含量為5.35%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理 采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取180頭遺傳背景相同、胎次相近、體重接近的21日齡斷奶仔豬，隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9頭仔豬。4個(gè)處理分別飼喂對(duì)照飼糧（對(duì)照組）、0.15%酵母壁多糖飼糧（0.15%組）、0.45%酵母壁多糖飼糧（0.30%組）和0.45%酵母壁多糖飼糧（0.45%組）。試驗(yàn)期為21 d。試驗(yàn)開始前對(duì)豬舍進(jìn)行充分沖洗和嚴(yán)格消毒。試驗(yàn)期內(nèi)仔豬飼養(yǎng)于裝有高床、漏縫地板、乳頭式飲水器的保育舍。每日飼喂仔豬4～5次，所有仔豬自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理措施、免疫程序按豬場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行。飼糧配方參照NRC（2012）和我國豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）配制，飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

1.3 樣品采集及處理 在試驗(yàn)第21天，從每個(gè)重復(fù)中選取1頭接近平均體重且健康狀況良好的仔豬，肌注4%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。待麻醉完全后，采用頸靜脈放血將其處死，在無菌狀態(tài)下采集盲腸內(nèi)容物，置于液氮中速凍，-80℃中保存。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 盲腸微生物分析

1.4.1 引物的設(shè)計(jì) 利用細(xì)菌總DNA作為模板，使用細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中通用引物序列：515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

1.4.2 盲腸總DNA提取和MiSeq測(cè)序 將盲腸樣品4℃條件下解凍，采用QIAamp DNA Stool MiniKit提取微生物總DNA，使用1%濃度的瓊脂糖凝膠在150 V電壓下電泳約40 min，利用NanoDrop?ND1000測(cè)定DNA條帶質(zhì)量。純化后的16S r RNA基因V4區(qū)的PCR產(chǎn)物送至華大基因檢測(cè)，通過Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序。

1.4.3 生物分析流程 對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列，獲得的高質(zhì)量Clean Data用于后期分析。通過reads之間的Overlap關(guān)系將reads拼接成Tags。以16S rDNA序列97%的相似度作為分類操作單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）的劃分標(biāo)準(zhǔn)。通過OTU與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋。利用mothur對(duì)獲得的OTU做rarefaction、豐富度（Chao和Ace）和多樣性分析（Shannon和Simpson），并做組間物種差異分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)用Excel 2003簡(jiǎn)單處理后，采用SPSS 17.0軟件One-Way ANOVA模型進(jìn)行方差分析數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha多樣性分析 對(duì)20個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序，通過reads之間的overlap關(guān)系拼接成Tags，一共得到619 399條Tags，平均每個(gè)樣品30 969條。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行Rank-Abundance分析（圖1），從橫軸上的長(zhǎng)度來看，物種組成豐富度、物種組成均勻度由高到低均為0.30%酵母壁多糖組、0.15%酵母壁多糖組、0.45%酵母壁多糖組、對(duì)照組。

由圖2可知，各組細(xì)菌Alpha指數(shù)稀釋曲線在測(cè)序條數(shù)達(dá)到15 000條以上時(shí)趨于平臺(tái)期。由表2可知，各組Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù)雖然差異不顯著（P＞0.05），但隨酵母壁多糖添加量增多，Chao指數(shù)和Ace指數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在不考慮群落中每個(gè)物種的豐度前提下，0.30%酵母壁多糖組仔豬盲腸菌群最豐富。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在各組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸細(xì)菌影響的Rank-Abundance分析圖

2.2 Beta多樣性分析 為了進(jìn)一步研究樣品多樣性方面存在的差異，對(duì)樣品進(jìn)行Beta多樣性（Beta Diversity）分析。基于樣品OTU進(jìn)行聚類分析，在考慮了序列豐度的前提下，構(gòu)建盲腸細(xì)菌多樣系相似度樹狀圖。由圖3可知，各組重復(fù)性較好，且隨酵母壁多糖添加量提高，各組仔豬盲腸內(nèi)容物菌群相似度越來越低，0.45%酵母壁多糖與對(duì)照組相比相似度最低。

表2 酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸細(xì)菌群落α-多樣性影響

圖2 酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸細(xì)菌群落多樣性Alpha指數(shù)稀釋曲線影響

圖3 酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸細(xì)菌影響的聚類分析樹狀圖（Weighted UniFrac）

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析 對(duì)照組、0.15%酵母壁多糖組、0.30%酵母壁多糖組和0.45%酵母壁多糖組OTUs總數(shù)分別為660、699、682和686。共有的OTU數(shù)為533。對(duì)OTU進(jìn)行物種分析，16個(gè)門、26個(gè)綱、61個(gè)科、81個(gè)屬和102個(gè)種在所有樣品中被鑒定。由表3可知，Bacteroidetes（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Spirochaetes（螺旋體門）和Proteobacteria（變形菌門）相對(duì)含量較高；Tenericutes（軟壁菌門）、Deferribacteres（脫鐵桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）和Fibrobacteres（纖維桿菌門）含量較低，屬于劣勢(shì)菌門；擬桿菌門、厚壁菌門和軟壁菌門在各組間差異顯著，與對(duì)照組相比，添加0.30%酵母壁多糖能顯著降低仔豬腸道擬桿菌門含量（P＜0.05），而添加0.30%和0.45%酵母壁多糖顯著增加盲腸厚壁菌門含量（P＜0.05）；添加0.45%酵母壁多糖還能顯著提高仔豬盲腸軟壁菌門含量（P＜0.05）。此外，酵母壁多糖具有降低盲腸變形菌門含量的趨勢(shì)（P=0.066）。

表3 不同水平酵母壁多糖對(duì)盲腸細(xì)菌組成的影響（門水平）

由表4可知，Prevotella（普氏菌屬）、Bacteroides（擬桿菌屬）、Oscillospira（顫螺菌屬）、Parabacteroides（紫單胞菌屬）、Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）、Sphaerochaeta屬和CF231屬是仔豬盲腸優(yōu)勢(shì)菌屬。添加0.30%和0.45%酵母壁多糖能提高仔豬盲腸Anaerovibrio（厭氧弧菌屬）和Ruminococcus（瘤胃桿菌屬）含量（P＜0.05），并降低Streptococcus（鏈球菌屬）的含量（P＜0.05）。而相比于對(duì)照組，添加0.30%酵母壁多糖能提高盲腸CF231屬含量（P＜0.05）。此外，酵母壁多糖還能提高仔豬盲腸Coprococcus（糞球菌屬）和Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）含量（P＜0.05），并降低Sphaerochaeta屬含量（P＜0.05）。

3 討 論

后腸段是仔豬腸道中微生物的豐富部位，其中盲腸微生物菌群多樣性較高，數(shù)量達(dá)每克食糜1011個(gè)[9]。腸道內(nèi)的菌群粘附于腸黏膜上，并與腸上皮細(xì)胞粘連，形成機(jī)體的微生物屏障。它不僅改變了腸道的通透性，還與機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、代謝和免疫系統(tǒng)有著不可分割的聯(lián)系。在某種程度上，可將腸道菌群視為一種特殊的機(jī)體器官[1]。腸道微生物的動(dòng)態(tài)平衡是仔豬健康生長(zhǎng)的重要前提。在腸道菌群平衡的基礎(chǔ)上，腸道中有益菌含量越高，畜禽越健康[10]。環(huán)境和日糧因素均會(huì)改變腸道菌群。

OTU Rank曲線是展現(xiàn)樣品中物種多樣性的一種形式，可以同時(shí)解釋樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。Alpha多樣性（Alpha Diversity）是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包括Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)菌Alpha指數(shù)稀釋曲線在測(cè)序條數(shù)達(dá)到15 000條以上時(shí)，趨于平臺(tái)期，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，足夠代表物種的豐富度。本研究結(jié)果顯示，酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬腸道菌群Alpha多樣性影響不大，但在不考慮群落中每個(gè)物種的豐度前提下，0.30%酵母壁多糖組仔豬盲腸菌群最豐富；Beta多樣性分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酵母壁多糖添加量為0.45%時(shí)，仔豬盲腸菌群與對(duì)照組差異最大，但0.15%組和0.30%組與對(duì)照組差異較小，且添加量0.15%的酵母壁多糖組相似性沒其他組別好，這可能是由于胃腸道的復(fù)雜性，使得動(dòng)物個(gè)體面對(duì)飼糧改變時(shí)，出現(xiàn)了個(gè)別不同的應(yīng)答[11]。也可能是酵母壁多糖添加量較低，還沒有達(dá)到改變腸道菌群的量，即只有當(dāng)酵母壁多糖添加量達(dá)到一定程度時(shí)才能達(dá)到改變腸道菌群的效果。

表4 不同水平酵母壁多糖對(duì)盲腸細(xì)菌組成的影響（屬水平）

大量研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物主要以厭氧菌為主，嚴(yán)格厭氧菌的數(shù)量比兼性厭氧和需氧菌多2～3個(gè)數(shù)量級(jí)[12]。菌群結(jié)構(gòu)門水平分析發(fā)現(xiàn)，腸道中優(yōu)勢(shì)菌門主要是擬桿菌門和厚壁菌門[13-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為仔豬盲腸優(yōu)勢(shì)菌門，而軟壁菌門、脫鐵桿菌門、放線菌門和纖維桿菌門含量較低；相比于對(duì)照組，添加0.30%酵母壁多糖能顯著降低斷奶仔豬腸道擬桿菌門含量。這與Nakashimada等[18]研究結(jié)果相似。由于厚壁菌門和擬桿菌門具有降解多糖和促進(jìn)機(jī)體能量吸收的作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，0.30%和0.45%酵母壁多糖組盲腸厚壁菌門含量顯著高于對(duì)照組。此外，添加0.45%酵母壁多糖還能顯著提高斷奶仔豬盲腸軟壁菌門含量。進(jìn)一步在屬水平分析發(fā)現(xiàn)，普氏菌屬為仔豬腸道主要菌屬。普氏菌屬的主要功能是降解粘蛋白和半纖維素、木聚素等植物性碳水化合物[19-20]。厭氧弧菌屬和瘤胃桿菌屬主要分解糖和纖維素[13]，在反芻動(dòng)物體內(nèi)含量較高。本研究發(fā)現(xiàn)，添加0.30%和0.45%酵母壁多糖能顯著提高仔豬盲腸厭氧弧菌屬和瘤胃桿菌屬含量。添加酵母壁多糖可能有利于仔豬盲腸對(duì)植物碳水化合物的消化利用。此外，酵母壁多糖還能顯著提高斷奶仔豬盲腸糞球菌屬和考拉桿菌屬的含量，并能顯著降低鏈球菌屬和Sphaerochaeta屬含量。

4 結(jié) 論

當(dāng)酵母壁多糖添加量達(dá)一定水平時(shí)，短期可改善斷奶仔豬盲腸部分微生物含量。酵母壁多糖能顯著提高斷奶仔豬盲腸厚壁菌門含量以及瘤胃桿菌屬和糞球菌屬等優(yōu)勢(shì)菌群的含量。

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Ef f ect of Yeast Cell Wall Polysaccharides on Cecum Bacteria Structure of Weaned Piglets by MiSeq Sequencing Technology

HE Qin1, WANG Zi‐rui1, YOU Jin‐ming1*, CHEN Li‐ling1,2, LU Ya‐fei1, LI Lan‐hai1

(1.Nutrition Feed Development Engineering Center of Jiangxi Province, College of Animal Science and Technology, Key Laboratory of Animal Nutrition in Jiangxi Province, Jiangxi Agricultural University, Jiangxi Nanchang 330045, China; 2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Laboratory Animal Research Center for Science and Technology, Jiangxi Nanchang 330004, China)

An experiment was conducted to determine the effects of yeast cell wall polysaccharides on cecum bacteria structure of weaned piglets. A total of one hundred and eighty piglets with the similar genetic background, health condition, parity and body weight which weaned at 21 days of age were randomly allotted to 4 groups with 5 replicated each and 9 pigs in each replicate. Pigs in the four groups were fed control (without yeast cell wall polysaccharide), 0.15% of yeast cell wall polysaccharide, 0.30% yeast cell wall polysaccharide and 0.45% yeast cell wall polysaccharide, respectively. The experiment lasted for 21 days. After 21 days, the piglets were killed and the samples of cecum content were collected. Total bacterial DNA of 20 samples of pigs per group was extracted, and used to amplify PCR for 16Sr RNA gene V4 tag fragment and sequence using high‐throughput MiSeq technique. Based on the QIIME platform, the microbial community diversity in cecum content was compared. The results showed as follows: There were no significant differences on bacterial diversity in piglets receiving control diets and yeast cell wall polysaccharides. To a certain extent, dietary supplementation yeast cell wall polysaccharides can change the bacterial diversity, and without considering the abundance of each species, 0.30% yeast cell wall polysaccharide cecum flora was the most abundant. Bacteroidetes, Firmicutes, Spirochaetes and Proteobacteria were the dominant phyla in cecum content of piglets. Compared with the control group, dietary supplementation of 0.30% yeast cell wall polysaccharide signif i cantly decreased Bacteroidetes (P＜0.05), 0.30% and 0.45% yeast cell wall polysaccharides significantly increased the amounts of Firmicutes. Added 0.45% yeast cell wall polysaccharide can signif i cantly increase the Tenericutes of cecum, in addition, Yeast cell wall polysaccharide could reduce the Proteobacteria of cecum, but there were no significant differences (P=0.066). Prevotella were the dominant genus in cecum content of piglets. The yeast cell wall polysaccharides enhance(P＜0.05) Anaerovibrio, Ruminococcus, Coprococcus and Phascolarctobacterium, and reduced the Streptococcus of cecum(P＜0.05). Accordingly, diets with yeast cell wall polysaccharides in short feeding‐period could improve the cecum bacteria structure of weaned piglets. Diets with yeast cell wall polysaccharides could enhance the Advantage bacterium of cecum, such as Firmicutes, Ruminococcus, Coprococcus,etc.

Yeast cell wall polysaccharides; Weaned piglets; Bacteria structure; Flora diversity

S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-125

2017-03-13；

2017-04-19

江西省重大科技專項(xiàng)（20143ACF60001）；江西省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（JXARS-03-營(yíng)養(yǎng)與飼料崗）

賀琴（1993-），女，江西蓮花人，碩士研究生，研究方向?yàn)樨i營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：171836219@qq.com

*通訊作者：游金明，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：youjinm@163.com