張海波，王之盛

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，四川雅安 750001）

精料補充料能量水平對肉牛瘤胃發(fā)酵特性及微生物菌群的影響

張海波1*，王之盛2

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，四川雅安 750001）

本試驗旨在研究精料補充料（精補料）能量水平對肉牛瘤胃發(fā)酵特性及瘤胃微生物菌群的影響。選用3頭安裝永久性瘤胃瘺管的宣漢黃牛，采用3×3拉丁方設(shè)計，試驗牛分別飼喂綜合凈能為7.49 MJ/kg（低能組）、8.85 MJ/kg（中能組）、10.19 MJ/kg（高能組）的精補料，測定飼喂后0、3、6、9、12 h瘤胃液pH、氨氮（NH3-N）、揮發(fā)性脂肪酸、微生物蛋白及微生物相對含量。結(jié)果表明：高能組丙酸（3、9、12 h和平均）、微生物蛋白（9、12 h和平均）、原蟲（3、6、9、12 h和平均）和牛鏈球菌（9、12 h和平均）顯著高于低能組（P＜0.05），乙酸/丙酸（3、12 h和平均）、NH3-N濃度（3、6、9 h和平均）和溶纖維丁酸弧菌（6、9、12 h和平均）顯著低于低能組（P＜0.05）。綜上所述，提高精補料的能量水平，肉牛瘤胃中原蟲和牛鏈球菌增多，溶纖維丁酸弧菌減少，從而引起丙酸升高，降低乙酸/丙酸和NH3-N濃度，使微生物蛋白增加。

肉牛；能量水平；瘤胃發(fā)酵特性；微生物菌群

牛肉素以高蛋白、低脂肪、低膽固醇含量等優(yōu)良品質(zhì)深受消費者喜愛，但與龐大的市場需求相比，我國的肉牛養(yǎng)殖并不能滿足需要。大力發(fā)展標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化養(yǎng)殖、施行精準(zhǔn)飼養(yǎng)、提高飼料利用效率是解決供需矛盾的有效手段。

肉牛有超過一半的蛋白質(zhì)需要來自從瘤胃進入十二指腸的微生物蛋白[1]，故精準(zhǔn)飼養(yǎng)、提高飼料利用效率的關(guān)鍵點就是要提高瘤胃微生物蛋白的合成。飼料中的能量和蛋白質(zhì)是瘤胃微生物蛋白合成的主要營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量一定時，能量則成為微生物蛋白合的主要限制因素[2-3]，且瘤胃內(nèi)飼料主要是通過瘤胃微生物進行降解。溶纖維丁酸弧菌是瘤胃內(nèi)重要的纖維降解菌之一，能降解日糧中的纖維[4]。牛鏈球菌是反芻動物瘤胃中主要的淀粉降解菌之一，其主要生理作用是降解和利用淀粉來維持自身生長[5]。此外，與傳統(tǒng)的體外發(fā)酵技術(shù)相比，運用瘤胃瘺管技術(shù)可以控制瘤胃內(nèi)環(huán)境，更真實地反映瘤胃發(fā)酵情況。

以前的研究多集中在利用體外發(fā)酵技術(shù)研究能量水平對反芻動物瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響[6-7]，而運用瘤胃瘺管技術(shù)研究精料補充料（以下簡稱精補料）能量水平對肉牛瘤胃微生物菌群的影響較少。本試驗旨在研究精補料能量水平對肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物菌群的影響，為合理配制肉牛精補料能量水平提供理論依據(jù)和基本參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理 選取3頭年齡相近，體況良好，體重為（312.5±23.85）kg，安裝永久性瘤胃、十二指腸近端和回腸末端瘺管的去勢宣漢黃牛。宣漢黃牛的飼養(yǎng)管理按照肉牛的常規(guī)飼養(yǎng)管理進行，每天定時（08:00和16:00）飼喂2次，自由飲水。

1.2 試驗設(shè)計及日糧 參照中國肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[8]，設(shè)計3種精補料能量水平。3種精補料綜合凈能分別為 7.49（低能量水平）、8.85（中能量水平）、10.19 MJ/kg（高能量水平），精補料配方及營養(yǎng)成分見表1。精料粗料比為4:6，粗料為稻草，飼喂時先粗料后精補料，每頭牛每天飼喂2.15 kg的精補料和3 kg的稻草。稻草飼喂時加工成4 cm左右的短節(jié)。稻草的營養(yǎng)成分：干物質(zhì)90.88 %，綜合凈能為1.92 MJ/kg，粗蛋白5.55 %，粗纖維24.10 %，酸性洗滌纖維67.96 %，中性洗滌纖維45.71 %，鈣0.07 %，磷0.05 %。采用3×3拉丁方試驗設(shè)計，進行3期動物試驗，每期20 d，其中15 d為預(yù)試期，5 d為采樣期。

1.3 樣品的采集 每期的第16天，在飼喂后0、3、6、9、12 h分別采集瘤胃液100 mL，經(jīng)4層紗布過濾后，取10 mL立即測定瘤胃pH，剩下的瘤胃液分成2部分保存，一部分放入-20℃用于瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定，另一部分立即放入液氮用于微生物菌群的測定。

1.4 飼料常規(guī)營養(yǎng)成分測定 參照張麗英[9]的方法分別測定3種料補料的粗蛋白、粗纖維、鈣、磷、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。

表1 精補料組成和營養(yǎng)成分

1.5 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定 瘤胃pH采用pH計（上海雷磁，pHS-3D型）測定。瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸（VFA）采用CP-3800氣相色譜測定。瘤胃液氨氮（NH3-N）濃度參照馮宗慈等[10]的方法測定。采用Makkar等[11]的方法測定瘤胃微生物蛋白。

1.6 微生物菌群的測定 參照細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP302-02）的說明方法抽提瘤胃液總DNA。實時熒光定量PCR引物見表2。采用Denman等[12]的方法，用總菌做內(nèi)參，計算目標(biāo)微生物的相對豐度。

1.7 統(tǒng)計分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。差異顯著時采用Duncan's方法對各組間平均數(shù)進行多重比較，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。P＜0.05為差異顯著。

表2 實時熒光定量PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 精補料能量水平對瘤胃pH的影響 由表3可知，各處理組瘤胃pH在各個時間點的差異不顯著（P＞0.05），但平均以低能組最高，高能組最低。2.2 精補料能量水平對瘤胃VFA的影響 由表4可知，高能組丙酸（3、9、12 h和平均）顯著高于低能組（P＜0.05）；高能組丙酸（3 h和平均）顯著高于中能組（P＜0.05）。高能組乙酸/丙酸（3、12 h和平均）顯著低于低能組（P＜0.05）。

表3 精補料能量水平對瘤胃pH的影響

表4 精補料能量水平對瘤胃VFA的影響

2.3 精補料能量水平對瘤胃NH3-N的影響 由表5可知，低能組NH3-N濃度（3、6、9 h和平均）顯著高于高能組（P＜0.05），顯著高于中能組（平均）（P＜0.05）。中能組和高能組與低能組相比NH3-N濃度（平均）分別降低了23.65%和43.14%（P＜0.05）。

表5 精補料能量水平對瘤胃NH3-N的影響 mg/100mL

2.4 精補料能量水平對瘤胃微生物蛋白的影響 由表6可知，高能組微生物蛋白含量（9、12 h和平均）顯著高于低能組（P＜0.05），顯著高于中能組（9 h和12 h）（P＜0.05）。中能組和高能組與低能組相比微生物蛋白含量（平均）分別提高了10.61%和25.92%。

表6 精補料能量水平對瘤胃微生物蛋白的影響 mg/mL

2.5 精補料能量水平對瘤胃微生物菌群的影響 由表7可知，高能組瘤胃中原蟲（3、6、9、12 h和平均）和牛鏈球菌（9、12 h和平均）顯著高于低能組（P＜0.05）；高能組瘤胃中原蟲（3、6、9 h和平均）和牛鏈球菌（9、12 h和平均）顯著高于中能組（P＜0.05）。高能組瘤胃中溶纖維丁酸弧菌（6、9、12 h和平均）顯著低于低能組（P＜0.05），顯著低于中能組（6、9 h和平均）（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 精補料能量水平對瘤胃pH的影響 瘤胃液pH是綜合反映瘤胃發(fā)酵過程的指標(biāo)之一，對日糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝有重要影響。在本試驗中，各處理組瘤胃液pH在各個時間點的差異不顯著，但高能量組的pH最低，低能量組的pH最高。較高能量水平的精補料中，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量較高，結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量降低，從而在短時間內(nèi)即可產(chǎn)生大量VFA，導(dǎo)致瘤胃液pH下降[6]，而由于瘤胃液具有緩沖能力，最終使瘤胃液pH下降不明顯，但還是有隨著精補料能量升高而瘤胃液pH下降的趨勢。

表7 精補料能量水平對瘤胃微生物菌群的影響

3.2 精補料能量水平對瘤胃VFA的影響 碳水化合物在瘤胃微生物的作用下生成VFA（包括乙酸、丙酸、丁酸等），是瘤胃微生物生長的主要能量來源。在本試驗中，隨著精補料能量升高，丙酸濃度升高，乙酸/丙酸降低?？赡苁窃谳^高能量水平的精補料中，瘤胃發(fā)酵程度增加，丙酸量隨之增加[13]，形成丙酸發(fā)酵模式，最終表現(xiàn)為乙酸/丙酸降低。增加非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（可降解淀粉）的含量，可以增加瘤胃丙酸的含量，降低乙酸/丙酸[13]。

3.3 精補料能量水平對瘤胃NH3-N的影響 本研究中，隨著精補料能量增加，瘤胃NH3-N濃度降低。提高日糧能量水平，為微生物繁殖提供充足的能量，有利于微生物數(shù)量增加，促進微生物對NH3-N利用增多，從而降低NH3-N濃度。Lee等[14]研究也表明，隨著底物碳水化合物的增加，培養(yǎng)液中NH3-N濃度降低。

3.4 精補料能量水平對瘤胃微生物蛋白的影響 本試驗中，隨著精補料能量增加瘤胃微生物蛋白升高，與Zhang等[7]研究結(jié)果一致。這可能是提高了日糧能量水平，有利于微生物數(shù)量增加，從而使微生物蛋白升高。

3.3 精補料能量水平對瘤胃微生物菌群的影響 本試驗中，隨著精補料能量增加，瘤胃原蟲數(shù)量增多，與Zhang等[7]的結(jié)果一致。這可能是隨著精補料能量增加，為原蟲的繁殖提供了充足的能量，有利于原蟲的繁殖。但Faciola等[15]研究表明，原蟲具有吞噬細菌的功能，能夠減少從瘤胃進入十二指腸的細菌蛋白。瘤胃微生物蛋白主要由原蟲蛋白和細菌蛋白組成，原蟲能夠吞噬細菌，讓細菌蛋白變成原蟲蛋白的一部分，故原蟲數(shù)量的增加促進微生物蛋白的合成。

溶纖維丁酸弧菌是反芻動物瘤胃中主要纖維降解菌之一，其主要生理作用是對飼料中的纖維和蛋白進行降解[4]。本試驗結(jié)果表明，隨著精補料能量增加溶纖維丁酸弧菌數(shù)量減少，與張海波[6]體外發(fā)酵研究結(jié)果一致。其原因可能是較高能量水平的精補料中，日糧中酸性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量降低，而發(fā)酵底物（中酸性洗滌纖維和酸性洗滌纖維）的減少導(dǎo)致溶纖維丁酸弧菌數(shù)量減少。

牛鏈球菌是反芻動物瘤胃中主要淀粉降解菌之一，其主要生理作用是降解和利用淀粉來維持自身生長[5]。本試驗中，隨著精補料能量增加，瘤胃中牛鏈球菌數(shù)量增多。其原因可能是較高能量水平的精補料中，提高了日糧淀粉比例，有利于瘤胃牛鏈球菌繁殖，導(dǎo)致牛鏈球菌增加。Tajima等[16]利用實時熒光定量PCR技術(shù)研究表明，日糧從干草型轉(zhuǎn)換到谷物型可以顯著增加荷斯坦奶牛瘤胃牛鏈球菌的數(shù)量。

4 結(jié) 論

隨著精補料能量水平增加，肉牛瘤胃中原蟲和牛鏈球菌增加，溶纖維丁酸弧菌減少，從而引起丙酸升高，降低乙酸/丙酸和NH3-N濃度，使微生物蛋白增加。綜合考慮，效果最佳的精補料能量水平為高能組（10.19 MJ/kg）。

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Rumen Fermentation and Rumen Microbes in Beef Cattle Receiving Diets with Dif f erent Dietary Energy Level of Concentrate Supplement

ZHANG Hai‐bo1*, WANG Zhi‐sheng2

(1. College of Life Science and Environmetal Resource, Yichun University, Jiangxi Yichun 336000, China; 2. Animal Nutrition Institute of Sichuan Agricultural University, Sichuan Ya’an 625014, China)

The objective of the experiment was to evaluate the ef f ects of energy level of concentrate supplement on rumen fermentation characteristics and microbial population in beef cattle. The three concentrate supplement energy levels were low dietary density (7.49 MJ/kg), medium dietary density (8.85 MJ/kg) and high dietary density (10.19 MJ/kg). Rumen fl uid were used to pH, ammonia (NH3‐N), volatile fatty acid (VFA), microbial protein and microbial relative content after 0, 3, 6, 9, and 12 h feeding. Groups were assigned as 3×3 Latin squares design. Results show that the propionic acid (3 , 9 , 12 h and average), microbial protein (9, 12 h and average), protozoa (9, 3, 6, 12 h and average) and Streptococcus bovis (9, 12 h and average) in high energy group were signif i cantly higher than in low energy group (P＜0.05), while acetate to propionate ratio (3, 12 h and average) and NH3‐N (3, 6, 9 h and average) and butyrivibrio fi brisolvens (9, 6, 12 h and average) was signif i cantly lower (P＜0.05). These results indicated that protozoa and Streptococcus bovis were growth with concentrate supplement of energy increasing, while inhibit butyrivibrio fi brisolvens growth; which increase the propionic acid, decrease acetate to propionate ratio and NH3‐N, so as to make the microbial protein concentration increasing.

Cattle; Energy level; Ruminal fermentation characteristics; Microbial community structure

S823.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-097

2017-02-14；

2017-04-18

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)體系資助項目（CARS-38）和宜春學(xué)院博士科研啟動基金（3350100050）

張海波（1985-），男，重慶開州人，博士，講師，主要從事反芻動物營養(yǎng)研究，E-mail: zhanghaiboainide@163. com

* 通訊作者