李紀(jì)遠(yuǎn) 張燦斌 馬 新 王 強(qiáng) 王 獻(xiàn) 鄭帥玉

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，洛陽(yáng)471000)

長(zhǎng)鏈非編碼H19靶向調(diào)節(jié)miR-107通過(guò)Notch通路對(duì)肺癌的侵襲遷移的影響

李紀(jì)遠(yuǎn) 張燦斌 馬 新①王 強(qiáng) 王 獻(xiàn) 鄭帥玉

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，洛陽(yáng)471000)

目的：探討長(zhǎng)鏈非編碼H19靶向調(diào)節(jié)miR-107通過(guò)Notch通路對(duì)肺癌的侵襲遷移的影響情況。方法：qPCR檢測(cè)肺癌和癌旁組織、不同肺癌細(xì)胞中H19的表達(dá)情況；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默H19后肺癌細(xì)胞侵襲能力的變化；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默H19后肺癌細(xì)胞遷移能力的變化；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)H19與miR-107的相互作用；qPCR檢測(cè)肺癌和癌旁組織、不同肺癌細(xì)胞中miR-107的表達(dá)情況；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默H19后miR-107對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默H19后miR-107肺癌細(xì)胞遷移能力的影響；裸鼠皮下成瘤檢測(cè)沉默H19后miR-107對(duì)肺癌成瘤大小以及體積的影響。Western blot檢測(cè)沉默H19后Notch通路蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：與癌旁組織相比，肺癌組織中H19表達(dá)明顯增高；肺癌細(xì)胞A549中H19表達(dá)水平最高；沉默H19可以抑制肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力；H19能與miR-107的3′UTR特異性結(jié)合；與癌旁組織相比，肺癌組織中miR-107表達(dá)明顯降低；沉默H19后，抑制miR-107可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力；與H19-siRNA組相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor組荷瘤小鼠腫瘤體積和重量都明顯增大。沉默H19后Notch通路蛋白表達(dá)情況相應(yīng)下調(diào)。結(jié)論：H19在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，H19可以靶向調(diào)節(jié)miR-107通過(guò)Notch信號(hào)通路調(diào)控肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

H19；肺癌；miR-107； 侵襲試驗(yàn)

近年來(lái)，肺癌發(fā)病率和死亡率呈急劇上升趨勢(shì)，而化療耐藥已成為當(dāng)今肺癌治療中亟需解決的一大難題[1]。近30年以來(lái)晚期肺癌患者的5年生存率依舊徘徊在20%左右，盡管經(jīng)腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和化療等治療，但80%左右患者仍會(huì)出現(xiàn)耐藥及復(fù)發(fā)的情況[2,3]，隨著分子生物學(xué)研究的深入，迫切需要新的分子靶向治療策略提高晚期肺癌患者的生存率。

H19基因在多種哺乳動(dòng)物中都呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，主要在肺、肝及胰腺組織中表達(dá)[4]。然而在人類中，僅在心臟和肌肉中存在[5]。H19基因主要包含5個(gè)外顯子集團(tuán)及4個(gè)內(nèi)含子集團(tuán)，本身不能編碼相關(guān)蛋白，缺乏開(kāi)放編碼區(qū)，是非編碼RNA的一種[5]。盡管在細(xì)胞核、細(xì)胞漿都可以檢測(cè)H19的表達(dá)，但H19主要表達(dá)區(qū)域是細(xì)胞漿，在細(xì)胞核中存在很少，可以調(diào)控下游蛋白發(fā)揮作用[6]。

微小RNA(miRNAs)是一種廣泛存在的單鏈RNA分子，對(duì)下游信使蛋白的表達(dá)有促進(jìn)或抑制的作用[7]。在人類腫瘤基因富集區(qū)域，存在大量的miRNA，影響著促癌基因和抑癌基因的突變行為，為惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)后提供研究靶點(diǎn)[8]。有研究表明，在肺癌組織中存在很多miRNA表達(dá)異常的情況[9]。近年有報(bào)道指出，肺癌、乳腺癌、膽管癌等不同類型的腫瘤組織中都存在miR-107的異常表達(dá)，提示miR-107在腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展中可以起到一定作用[10]。

Notch家族成員是多種腫瘤中共存的信號(hào)通路，對(duì)增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等細(xì)胞行為起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，其中在宮頸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌中Notch通路呈現(xiàn)持續(xù)激活的狀態(tài)[11-13]， Notch信號(hào)通路不僅可以扮演促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，還可以為腫瘤的治療方向提供理論幫助。本研究擬分析H19在肺癌中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討H19與miR-107的相互作用，明確二者在肺癌的遷移侵襲過(guò)程中的作用

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標(biāo)本采集及處理 收集2015年3月～2016年5月在我院收治的40例肺癌患者的癌和癌旁組織40例。所有患者術(shù)前無(wú)化療或放療，全部患者術(shù)后病理分期均經(jīng)2名副高以上病理科醫(yī)師共同閱片確定，腫瘤組織離體后迅速投入RNA保存液中。

1.1.2細(xì)胞株與主要試劑 人細(xì)胞 A549、PGCI3、PAa及H1299均購(gòu)于上海中山細(xì)胞庫(kù)，用含有10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液在 37℃、 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Hyclone公司(Hyclone,Logan,UT)。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司(Millipore,Billerica,MA)，Matrigel購(gòu)自Bio-Rad (Bio-Rad,Madrid,Spain)。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、miR-107-inhibitor購(gòu)自Gnenpharma(Gnenpharma Co.,Shanghai,China)，Trizol購(gòu)自Ambion(Ambion Inc.,Austin,TX,USA)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購(gòu)自日本ToYoBo公司(ToYoBo,FSQ-101,Japan)，PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(KapaBiosystems Inc.,Boston,US)。熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。熒光素酶報(bào)告載體由Promega公司合成(Promega Biotech Co.,Beijing,China)。

1.2方法

1.2.1qPCR檢測(cè)H19的表達(dá) qPCR法檢測(cè)H19表達(dá) 將不同組細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)瓶，接種密度為1×106ml-1， 培養(yǎng)36 h后按照Trizol說(shuō)明操作提取組細(xì)胞總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)核酸的濃度和純度。以DEPC水將各組總RNA稀釋調(diào)整為同一濃度，按步驟加入試劑，反應(yīng)完成后將 cDNA 于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每組反應(yīng)體系的體積為20 μl， 并各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔， 每組樣本cDNA 均需行目的RNA和內(nèi)參基因 GAPDH 熒光定量PCR擴(kuò)增。 根據(jù)ΔΔCT 法計(jì)算檢測(cè)基因反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，98℃ 5 min。后根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計(jì)算mRNA表達(dá)量。H19的引物序列：3′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-5′，5′-UCUCAAACUAGUACCGAGUC-3′。

1.2.2細(xì)胞病毒感染 調(diào)節(jié)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染前36 h接種于24孔板培養(yǎng)，第2天細(xì)胞密度達(dá)到50%～80%融合狀態(tài)。 將病毒置冰上融解后，按最佳MOI 值用培養(yǎng)液稀釋，加入終濃度為5 ng/ml 的凝聚胺(Polybrene)，輕輕混勻后加入到細(xì)胞中，將H19-siRNA和陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染細(xì)胞；按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書將miR-107-inhibitor和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在培養(yǎng)箱中孵育12 h 后換上完全培養(yǎng)基。病毒感染24 h后，熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞。

1.2.3Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 包被基底膜選擇孔徑為8 μm 的Transwel膜小室，培養(yǎng)基以1∶8 的比例稀釋 50 ml/L Matrigel，來(lái)包被 Transwell 小室底部膜的上表面，放置于37℃聚合成凝膠。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，向小室中加入500 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每孔注入5×103個(gè)細(xì)胞，放置于含 5%CO2的 37℃孵箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽輕輕擦去 Matrigel 基質(zhì)膠和上室的細(xì)胞，利用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色2 min，PBS 緩沖液清洗2次，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)后肺癌細(xì)胞遷移能力的影響 將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/ml，接種到6孔板中，放置于5%CO2溫箱孵育過(guò)夜，使細(xì)胞匯合度達(dá)到100%。細(xì)胞劃痕先用Marker筆在每個(gè)孔的背面做好標(biāo)記，以保證獲取數(shù)據(jù)的位置保持一致。用滅過(guò)菌的槍頭比著直尺，垂直于標(biāo)記線快速進(jìn)行劃痕。并用PBS緩沖液反復(fù)沖洗細(xì)胞孔，將懸浮細(xì)胞去除。向培養(yǎng)孔加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，放置于 5%CO2的 37℃孵箱孵育。 按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的時(shí)間點(diǎn)取樣，在顯微鏡下拍照。測(cè)量劃痕的初始距離(0 h)；在24、48、72 h后，分別測(cè)量劃痕的距離，并拍照，計(jì)算細(xì)胞的遷移率。

1.2.5熒光素酶活性檢測(cè) 將熒光素酶報(bào)告載體與H19-siRNA共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染pRL-TK作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)質(zhì)控。轉(zhuǎn)染36 h后，收獲細(xì)胞。按Promega公司熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)A549細(xì)胞熒光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.2.6裸鼠皮下成瘤觀察miR-107對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響 裸鼠大小選自4～6周齡。建立裸鼠體內(nèi)成瘤模型，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肺癌H19-siRNA細(xì)胞和H19-siRNA+miR-107-inhibitor組細(xì)胞。調(diào)整為細(xì)胞濃度為2×108ml-1。取0.1 ml細(xì)胞懸液注射于每只裸鼠左前肢腋窩皮下，共10只。注射后4周內(nèi)，監(jiān)控小鼠的存活率、體重和生存狀態(tài)，測(cè)量剛死亡小鼠的腫瘤的尺寸、重量。

2 結(jié)果

2.1肺癌組織、癌旁組織中以及肺癌細(xì)胞中H19 mRNA的表達(dá) qPCR結(jié)果表明：與癌旁組織相比，肺癌癌組織中H19 mRNA表達(dá)水平明顯增高[(0.82±0.03) vs (0.17±0.02),P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)；不同肺癌細(xì)胞中，A549細(xì)胞H19的表達(dá)水平最高(圖1B)，結(jié)合以上結(jié)果，考慮H19在肺癌中起促癌作用，我們挑選A549為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

2.2H19-siRNA對(duì)人肺癌細(xì)胞A549侵襲和遷移能力的影響 細(xì)胞侵襲穿過(guò)Matrigel的能力可以反映細(xì)胞的侵襲能力。圖2A顯示，使用H19-siRNA后，qPCR結(jié)果顯示，H19-siRNA可以減少H19的mRNA水平。Transwell結(jié)果顯示：NC組通過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為(179.2±7.4)，明顯多于H19-siRNA組(44.8±2.9)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2B。表明H19-siRNA可以抑制人肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與NC組相比，在24、48、72 h時(shí)，H19-siRNA組遷移率明顯降低[24 h (34.2±2.3)% vs (18.6±1.3)%,P<0.05; 48 h (62.8±4.8)% vs (39.9±3.1)%,P<0.05; 72 h (86.4±7.8)% vs (52.1±5.0)%,P<0.01]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C)。表明H19-siRNA可以抑制人肺癌細(xì)胞A549的遷移能力。

2.3熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)H19和miR-107的作用關(guān)系 qPCR結(jié)果表明：與癌旁組織相比，肺癌組織中miR-107 mRNA表達(dá)水平明顯降低[(0.83±0.08) vs (0.21±0.02),P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)；不同肺癌細(xì)胞中，A549細(xì)胞miR-107的表達(dá)水平表達(dá)最低(圖3B)。

圖1 qPCR檢測(cè)肺癌組織和細(xì)胞中H19的mRNA表達(dá)水平Fig.1 qPCR detection of lung cancer tissue and cell H19 mRNA expression levelsNote: A.H19 expression in lung cancer tissues was higher than that in adjacent normal lung tissues；B.H19 had the highest expression level in lung cancer A549 cell line.*.P<0.05.

為明確與H19相關(guān)的miRNA的情況，我們使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具明確，H19可能與miR-107直接相互作用，為了驗(yàn)證H19能否與miR-107 3′UTR結(jié)合，我們將H19-siRNA與miR-107共轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞A549中。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示(圖3C、D)：加入了H19的熒光素酶可以減弱miR-107的熒光素酶的活性，表明H19可以和miR-107的相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，明顯增強(qiáng)miR-107的熒光素酶活性 。結(jié)果表明，H19能與miR-107的3′UTR特異性結(jié)合。2.4沉默H19后，miR-107對(duì)人肺癌細(xì)胞A549侵襲和遷移能力的影響 Transwell結(jié)果顯示：H19-siRNA組通過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為(63.4±5.3)，明顯少于H19-siRNA+miR-107-inhibitor組(206.4±6.9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。表明沉默H19后，抑制miR-107可以促進(jìn)人肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與H19-siRNA組相比，在24、48、72 h時(shí)，H19-siRNA+miR-107-inhibitor組遷移率明顯增高[24 h (46.3±5.3)% vs (24.1±3.2)%,P<0.05; 48 h (65.1±4.2)% vs (38.1±3.0)%,P<0.05;72 h (88.3±6.2)% vs (51.1±5.1)%,P<0.01]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4B。表明沉默H19后，抑制miR-107可以促進(jìn)人肺癌細(xì)胞A549的遷移能力。

2.5裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明沉默H19后miR-107對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響 圖5A 顯示，沉默H19后，Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白水平的表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的下調(diào)，表明H19的表達(dá)可能通過(guò)影響Notch信號(hào)通路的激活影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況：與H19-siRNA組裸鼠腫瘤大小相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor組的腫瘤明顯大于H19-siRNA組(圖5B)。

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H19對(duì)A549細(xì)胞株侵襲和遷移能力的影響Fig.2 Transwell invasion test and scratch healing test to detect effect of H19 on invasion and migration of A549 cell linesNote: A.H19-siRNA transfection efficiency level；B.Inhibition of H19 expression can attenuate the ability of A549 cells to attack;C.Inhibition of H19 expression can reduce the migration of A549 cells.*.P<0.05.

圖3 miR-107在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及H19對(duì)miR-107的調(diào)控關(guān)系Fig.3 Expression of miR-107 in lung cancer tissues and cells and regulation of H19 on miR-107Note: A.miR-107 expression in lung cancer tissues was lower than that in adjacent normal tissues；B.miR-107 had the lowest expression level in A549；C.Inhibited the expression of miR-107 after H19 expression was increased accordingly;D.H19 can regulate the expression activity of miR-107.*.P<0.05.

圖4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-107對(duì)A549細(xì)胞株侵襲和遷移能力的影響Fig.4 Effect of miR-107 on invasion and migration of A549 cells was detected by Transwell invasion assay and scratch healing testNote: A.Effect of miR-107 on the invasion ability of A549 cells were detected after silencing H19 by Transwell matrigel invasion assays；B.Effect of miR-107 on the A549 cells migration ability were detected after silencing H19 by wound healing assays.Error bars represent standard error.*.P<0.05.

圖5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討沉默H19后miR-107對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of miR-107 on tumorigenesis after silencing H19 in vivoNote: A.Comparison of the tumor size of nude mice.B,C.Compare the volume and weight of the tumor in nude mice.*.P<0.05.

腫瘤重量和體積對(duì)比：與H19-siRNA組相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor組裸鼠腫瘤體積和重量都明顯大于H19-siRNA組[體積(0.785±0.023)cm3vs (0.029±0.002) cm3，P<0.05；重量(2.952±0.125)g vs (0.312±0.043)g，P<0.05]，見(jiàn)圖5C。

3 討論

H19基因在人類基因群中廣泛存在，可以干擾一些腫瘤的生物活性，比如肺癌、膠質(zhì)瘤等[14,15]。Moulton等[16]認(rèn)為，H19在腫瘤組織中表達(dá)水平受到明顯的抑制 ，表明H19具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，甚至是腫瘤發(fā)展中的關(guān)鍵因子。然而，有另外一些研究報(bào)道，H19也有一定的促癌作用。Bartolomei等[17]檢測(cè)了絨毛膜癌細(xì)胞株中H19的表達(dá)呈現(xiàn)較高水平，可能是誘導(dǎo)絨毛膜癌發(fā)展的基因。Zemel等[18]認(rèn)為H19基因還是診斷膀胱癌是否復(fù)發(fā)的重要標(biāo)志因子。Dey等[19]通過(guò)檢測(cè)肺癌組織和正常肺組織中H19的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)H19在肺癌組織中表達(dá)明顯增高，并且是肺癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。本研究通過(guò)檢測(cè)肺癌患者肺癌組織和癌旁組織H19的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中H19的表達(dá)明顯增高，結(jié)果與其他研究報(bào)道一致。

研究表明，H19的表達(dá)增高，可以導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)。Leighton等[20]研究表明，H19的表達(dá)水平與肺癌的分期有關(guān)，并且H19與肺癌浸潤(rùn)深度和轉(zhuǎn)移范圍呈一定相關(guān)關(guān)系。本研究通過(guò)沉默H19的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力變?nèi)酰Y(jié)合前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H19在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析證實(shí)，H19與miR-107有直接相互作用，進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)，H19可與miR-107 3′UTR結(jié)合。miR-107在多種非典型增生組織中表達(dá)水平異常，并影響其侵襲和轉(zhuǎn)移。有文獻(xiàn)指出miR-107能夠通過(guò)上調(diào)某些致癌基因或下調(diào)抑癌基因表達(dá)水平介導(dǎo)諸多腫瘤的發(fā)生[21]。Trivellin等[22]報(bào)道了miR-107參與結(jié)腸癌的血管生成。Sirotkin等[23]報(bào)道了miR-107參與了卵巢癌的細(xì)胞周期調(diào)控。然而在肺癌中miR-107表達(dá)情況及其作用還不清楚。本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)肺癌組織和癌旁組織miR-107的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-107在肺癌中表達(dá)明顯下調(diào)，表明miR-107在肺癌中起抑癌作用。結(jié)合前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)沉默H19，抑制miR-107的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步研究miR-107在肺癌細(xì)胞侵襲和遷移過(guò)程中的作用。結(jié)果表明，沉默H19后，抑制miR-107的表達(dá)可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。裸鼠皮下成瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也有類似結(jié)果。

本研究通過(guò)使用qPCR檢測(cè)H19和miR-107在肺癌和癌旁組織的表達(dá)，進(jìn)一步探討H19與miR-107的相互作用關(guān)系，研究H19與miR-107在肺癌細(xì)胞侵襲和遷移過(guò)程中的作用。研究表明H19在肺癌中表達(dá)上調(diào)，miR-107在肺癌中表達(dá)下調(diào)，H19與miR-107有直接相互作用。H19可以靶向通過(guò)miR-107調(diào)節(jié)肺癌的侵襲和遷移能力。H19可以調(diào)控Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，間接表明Notch信號(hào)通路在H19調(diào)控miR-107影響肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的過(guò)程中起到一定作用。提示H19和miR-107可能參與肺癌細(xì)胞侵襲、遷移過(guò)程，有可能成為預(yù)測(cè)肺癌進(jìn)展、預(yù)后和監(jiān)測(cè)治療效果的標(biāo)志物。

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[收稿2017-04-14 修回2017-05-17]

(編輯 張曉舟)

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Longnon-codingRNAH19promotedlungcancercellsmigrationandinvasionthroughmiR-107

LIJi-Yuan,ZHANGCan-Bin,MAXin,WANGQiang,WANGXian,ZHENGShuai-Yu.

DepartmentofThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofLuoyangUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471000,China

Objective:To investigate the effect and the related mechanism of H19 on the invasion and migration ability of pancreatic cancer cells.Methods: The expression of H19 in tissues of pancreatic carcinoma and non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma were detected.qPCR was used to detect the expression of H19 in different pancreatic cancer cells.The migration and invasion ability of pancreatic cancer cells was detected after silencing H19 using wound healing assays and Transwell matrigel invasion assays.Dual-Luciferase Reporter Assay System was used to detect miR-107regulating H19.The expression of miR-107 in tissues of pancreatic carcinoma and non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma were detected.The regulation of miR-107 on the migration and invasion ability of pancreatic cancer cells were detected after silencing H19 using wound healing assays and Transwell matrigel invasion assays.Subcutaneous tumor was used to detect the size and volume of the tumor after inject the tumor cells.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Ki67 and PCNA.Results: Compared with non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma,the expression of H19 of tissues of pancreatic carcinoma was significantly increased.The expression of H19 in pancreatic cancer cell A549 was highest.Silencing H19 could inhibit the migration of human pancreatic cancer A549 cells.miR-107 was the direct target of H19.Compared with non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma,the expression of H19 of tissues of pancreatic carcinoma was significantly decreased.After silencing H19,inhibiting the expression of miR107 could inhibit the migration of human pancreatic cancer A549 cells.Compared with the group of H19-siRNA,H19-siRNA+miR-107-inhibitor group mice tumor volume and weight were significantly bigger.Immunohistochemistry showed that compared with H19-siRNA group,the expression Ki67 and PCNA expression in H19-siRNA+miR-107-inhibitor group increased.Conclusion: H19 plays the role of tumor promotor factor in pancreatic cancer.H19 can affect the invasion and migration ability of pancreatic carcinoma cells by regulating miR-107.

H19；Pancreatic cancer；miR-107； Transwell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.024

李紀(jì)遠(yuǎn)(1980年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤研究，E-mail：lijiyuan1006@126.com。

R734.2

A

1000-484X(2017)09-1392-05

①河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，洛陽(yáng)471000。