李立萍 劉 超 解麗君 黃麗晶 郝 娜 葛 蘭 閆少峰 李國風 許曉紅 張勤增李蘭芳 姜 紅 張建新

(河北省疾病預防控制中心藥物研究所,石家莊050021)

非T細胞結合肽(FNS007)對膠原誘導型大鼠關節(jié)炎的影響①

李立萍 劉 超②解麗君 黃麗晶②郝 娜 葛 蘭②閆少峰②李國風 許曉紅②張勤增李蘭芳 姜 紅 張建新

(河北省疾病預防控制中心藥物研究所,石家莊050021)

目的：探討非T細胞結合肽(FNS007)對大鼠Ⅱ型膠原(Collagen typeⅡ,CⅡ)誘導的關節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)的影響及可能機制。方法：以牛CⅡ免疫Lewis大鼠誘發(fā)CIA模型后，隨機分為模型組、FNS007低(0.25 mg/kg)、中(0.5 mg/kg)、高(1.0 mg/kg)劑量組及陽性藥(甲氨蝶呤)組，另設空白對照組，尾靜脈注射相應藥物，隔天一次,空白對照組及模型組大鼠給予溶媒磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered solution,PBS)。實驗期間觀察踝關節(jié)寬度以及爪厚度，關節(jié)炎評分。給藥后第22天處死大鼠，ELISA法測定血清中TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平及抗CⅡ抗體水平；X光分析FNS007對CIA大鼠后爪骨損傷的療效，并對大鼠踝關節(jié)進行組織病理學檢查。結果：FNS007 高劑量明顯抑制CIA大鼠足爪腫脹程度，爪厚度和踝關節(jié)寬度明顯降低；炎癥評分明顯降低； 血清促炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量和抗CⅡ抗體的水平明顯降低； X光評分和組織病理評分明顯降低。FNS007 中劑量和低劑量組的以上指標也有不同程度的改善。結論：FNS007對大鼠CIA具有治療作用,其機制與其抑制T細胞活化，抑制CIA大鼠體內(nèi)抗CⅡ 的產(chǎn)生，并降低促炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量，從而抑制異常免疫反應有關。

非T細胞結合肽(FNS007)；膠原誘導型關節(jié)炎；類風濕關節(jié)炎；大鼠

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關節(jié)滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變，可引起關節(jié)腫痛，繼而導致軟骨破壞，引起關節(jié)畸形，最終出現(xiàn)不同程度的殘疾[1,2]。目前RA的治療以緩解病情的抗風濕藥和非甾體抗炎藥為主，此類藥物作用于發(fā)病的非起始環(huán)節(jié)，難以從根本上控制病變。本實驗中，非T細胞結合肽(FNS007，又稱NTAP)是直接針對 T 細胞發(fā)生作用的新型生物制劑，作用于RA發(fā)病的起始環(huán)節(jié)，抑制T細胞激活的第一信號 “T細胞受體(TCR) -抗原肽-人類白細胞 DR 抗原(HLA- DR)”三分子復合物的形成,與Ⅱ型膠原(CⅡ)原型肽競爭性結合HLA-DRβ1，進而抑制CⅡ引起的T細胞的增殖，從類風濕關節(jié)炎發(fā)病的中心環(huán)節(jié)遏止疾病的發(fā)生和發(fā)展，達到治療的目的。本文在前期研究基礎上在整體動物層面探索FNS007的作用效果及機制，為其應用于臨床治療RA提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 雌性Lewis大鼠，SPF級，6～7周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。牛Ⅱ型膠原蛋白(Collagen typeⅡ，Chondrex公司)；不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund′s adjuvant,IFA)購自Chondrex公司；FNS007(河北菲尼斯生物技術有限公司)；注射用甲氨蝶呤購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(96孔，RD公司)；大鼠CⅡ抗體ELISA試劑盒(96孔，Chondrex公司)。

1.2方法

1.2.1造模和給藥方法 冰浴條件下， 0.05 mol/L醋酸溶液與牛Ⅱ型膠原混勻，膠原的終濃度為2 mg/ml，放置在4℃過夜。次日，將膠原溶液與等體積IFA混合，冰浴攪拌至完全乳化為油包水白色乳液，膠原的終濃度為1 mg/ml。將100 μl乳化劑于大鼠的尾根部皮內(nèi)注射進行免疫，7 d后同法加強免疫1次[3]，觀察大鼠四肢關節(jié)腫脹情況，炎癥評分為1分時，隨機入組給予治療。

造模成功大鼠隨機分為模型組、FNS007低劑量(0.25 mg/kg)組、FNS007中劑量(0.5 mg/kg)組、FNS007高劑量(1.0 mg/kg)組和陽性藥[4](甲氨蝶呤，0.5 mg/kg)組，另設空白對照組。每組動物12只。FNS007 治療組隔天給藥一次，陽性藥每周給藥兩次，模型組和空白組給予PBS(隔天一次)，尾靜脈注射給藥，連續(xù)給藥21 d，于給藥后第22天處死大鼠。

1.2.2爪厚度和踝關節(jié)寬度測量 游標卡尺測量大鼠后爪厚度和踝關節(jié)寬度，從入組當天開始，隔天一次，直至給藥結束。

1.2.3CIA炎癥評分及標準 大鼠的每個爪子最高評為4分，每只大鼠最高評為16分，具體標準如下：0分=無關節(jié)紅腫；1分=關節(jié)輕度紅腫；2分=關節(jié)中度紅腫；3分=關節(jié)重度紅腫；4分=關節(jié)畸形或不能負重。大鼠入組后隔天進行一次評分，直至給藥結束。

1.2.4TNF-α、IFN-γ、IL-6和抗CⅡ抗體水平測定 治療結束后，麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，采用ELISA法測定血清中TNF-α、IFN-γ、和IL-6的水平以及血清中抗CⅡ抗體的水平。具體測定方法嚴格按照說明書。

1.2.5放射學檢查 治療結束后，麻醉處死大鼠，摘取后爪，采用柯達多模態(tài)小動物活體成像儀進行X光攝像，對所獲得的圖像進行跖骨損傷的評價，具體評分標準[5]如下：0分=關節(jié)間隙正常，骨輪廓完整；1分=1或2個外側跖骨出現(xiàn)輕微骨侵蝕；2分=第三到第五外側跖骨出現(xiàn)明顯的骨破壞；3分=所有外側跖骨均出現(xiàn)骨破壞，同時伴有第一、第二內(nèi)側跖骨的明顯骨侵蝕；4分=所有跖骨均出現(xiàn)明顯骨破壞，伴有至少一個內(nèi)側的跖骨關節(jié)完全毀損，只保留部分骨輪廓；5分=多處畸形毀損，骨輪廓消失。

1.2.6大鼠踝關節(jié)病理學檢查 大鼠踝關節(jié)經(jīng)脫鈣、石蠟包埋、4 μm切片、HE染色后，進行組織損傷評價，具體評分標準如下：0分=正常滑膜組織；1分=滑膜增生，炎性細胞浸潤；2分=血管翳形成，軟骨侵蝕；3分=大部分軟骨破壞伴軟骨下骨侵蝕；4分=關節(jié)完整性喪失，關節(jié)強直。

2 結果

2.1各組大鼠爪厚度測定結果 與空白組比較，模型組大鼠的爪厚度在第1～21天明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，甲氨蝶呤組的爪厚度在第3、11、17、19和21天明顯降低(P<0.05，P<0.01)；FNS007高劑量組在第3～21天明顯降低(P<0.05，P<0.01)；中劑量組的爪厚度在第3、5和7天明顯降低(P<0.05，P<0.01)(圖1)。

2.2各組大鼠踝關節(jié)寬度測定結果 與空白組比較，模型組大鼠踝關節(jié)寬度在第1～21天明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，甲氨蝶呤組大鼠踝關節(jié)寬度在第9、11、17和19天明顯降低(P<0.05)。FNS007高劑量組大鼠踝關節(jié)寬度在第3～21天明顯降低(P<0.05,P<0.01)(圖2)。

圖1 FNS007對CIA大鼠爪厚度的影響(mm)Fig.1 Effect of FNS007 on paw thickness (mm) in CIA miceNote: ##.P<0.01 compared with control group;*.P<0.05,**.P<0.01 compared with model group.

圖2 FNS007對CIA大鼠踝關節(jié)寬度的影響(mm)Fig.2 Effect of FNS007 on ankle joint width (mm) in CIA miceNote: ##.P<0.01 compared with control group;*.P<0.05,**.P<0.01 compared with model group.

2.3各組大鼠炎癥評分情況和時間曲線下面積(AUC)的變化 為了反應藥物對該指標整個病程的影響，并對藥物的整體作用效果進行評價，對炎癥評分AUC進行分析，與空白組比較，模型組大鼠的炎癥評分AUC明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組的炎癥評分AUC明顯降低(P<0.05)；FNS007中、高劑量組炎癥評分AUC明顯降低(P<0.05,P<0.01)(表1)。

2.4各組大鼠血清細胞因子測定結果 模型組大鼠血清中TNF-α、IFN-γ和IL-6水平較空白組明顯升高(P<0.01)，與模型組相比， FNS007高劑量組大鼠血清中的TNF-α、IFN-γ和IL-6水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)(表2)。

2.5各組大鼠血清抗CⅡ抗體水平測定結果 模型組大鼠血清中的抗CⅡ抗體水平較空白組明顯升高(P<0.01)，F(xiàn)NS007高劑量組大鼠血清中的抗CⅡ抗體水平明顯降低(P<0.05)(表2)。

2.6FNS007對CIA大鼠X光評分的影響 實驗結束后對各組大鼠進行后爪關節(jié)X線攝片及評分，結果顯示,模型組大鼠可見大部分關節(jié)軟組織重度腫脹，關節(jié)間隙變窄，軟骨和骨質(zhì)侵蝕破壞,甚至骨關節(jié)完全毀損。FNS007治療后關節(jié)破壞不同程度的減輕。X線評分顯示：與空白組比較，模型組大鼠的X光評分明顯升高(P<0.01),與模型組比較，F(xiàn)NS007高劑量組X光評分明顯降低(P<0.01)(圖3和表3)。

表1FNS007對CIA大鼠炎癥評分AUC的影響

Tab.1EffectofFNS007onAUCarthritisscoresofCIAmice

GroupsDosage(mg/kg)AUCarthriticscoresControlgroup-0.00±0.00Modelgroup-98.42±46.081)Methotrexategroup0.5058.50±22.722)Lowdosegroup0.2566.67±35.53Middledosegroup0.5062.58±41.952)Highdosegroup1.0047.42±38.623)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.05,3)P<0.01 vs model group.

表2FNS007對CIA大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-6和抗CⅡ抗體水平的影響

Tab.2EffectsofFNS007onTNF-α，IFN-γ，IL-6andanti-CⅡantibodylevelinserumofCIArats

GroupsTNF-α(ng/L)IFN-γ(ng/L)IL-6(ng/L)anti-CⅡantibody(μg/ml)Controlgroup32.35±3.86162.35±16.0212.85±2.34513.09±54.45Modelgroup47.81±5.251)204.67±22.761)21.98±7.011)3770.68±1722.891)Methotrexategroup47.27±5.67204.91±17.2717.23±2.362)2843.68±641.40Lowdosegroup45.37±6.29194.34±13.5517.76±7.313868.88±1758.99Middledosegroup44.00±5.55202.68±15.0320.84±2.363477.86±1191.71Highdosegroup40.19±5.943)186.41±14.442)16.97±4.902)2466.26±766.692)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.05,3)P<0.01 vs model group.

圖3 FNS007對CIA大鼠放射學改變的影響Fig.3 Effect of FNS007 on radiographic changes of paws in CIA rats

表3FNS007對CIA大鼠放射學評分和組織病理學評分的影響

Tab.3EffectsofFNS007onradiologicscoresandhistopathologyscoresofCIArats

GroupsDosage(mg/kg)RadiologicscoresHistopathologyscoresControlgroup-0.00±0.000.00±0.00Modelgroup-6.54±2.581)3.33±0.651)Methotrexategroup0.503.92±1.782)2.50±0.802)Lowdosegroup0.254.67±2.772.33±0.783)Middledosegroup0.504.33±3.222.00±0.953)Highdosegroup1.002.92±2.983)1.83±0.583)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.05,3)P<0.01 vs model group.

2.7FNS007對CIA大鼠組織病理學損傷的影響 病理結果顯示，空白對照組大鼠踝關節(jié)結構完整，關節(jié)面軟骨細胞排列整齊。模型組大鼠踝關節(jié)存在明顯的滑膜纖維組織增生，血管翳形成及炎性細胞浸潤，滑膜組織伸入關節(jié)腔內(nèi)，導致關節(jié)腔狹窄乃至閉塞；關節(jié)面軟骨大部乃至全部破壞，骨小梁結構排列紊亂。多數(shù)大鼠關節(jié)腔嚴重粘連甚至消失。FNS007各給藥組大鼠踝關節(jié)結構損傷程度均較模型組呈劑量依賴性不同程度明顯減輕，僅見少量滑膜組織增生及少量炎性細胞浸潤，未見關節(jié)腔閉鎖，關節(jié)強直(圖4)。

圖4 FNS007對CIA大鼠踝關節(jié)組織病理形態(tài)學的影響(HE，×200)Fig.4 Effect of FNS007 on ankle joint histopathologic examination (HE，×200)

病理評分結果如表3所示：與空白組比較，模型組大鼠的組織病理評分明顯升高(P<0.01)。與模型組比較， FNS007各給藥組組織病理評分與模型組相比均明顯降低(P<0.01)。

3 討論

RA是一種以慢性、多發(fā)性和對稱性關節(jié)炎為臨床特征的自身免疫疾病。其重要病理改變?yōu)殛P節(jié)滑膜組織增生，軟骨和骨組織被破壞，造成關節(jié)功能障礙。從免疫角度而言，膠原性關節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA) 模型更接近人類RA的發(fā)病機制，是目前研究RA的理想模型[6,7]。本文以Ⅱ型膠原免疫大鼠誘導CIA模型，動物表現(xiàn)為關節(jié)腫脹，關節(jié)及周圍組織炎性細胞浸潤,滑膜組織增生,關節(jié)結構破壞，血清TNF-α、IFN-γ、IL-6及抗CⅡ抗體水平升高，提示CIA模型制備成功。

研究表明，Th1及其分泌的細胞因子過量在RA發(fā)病機制中起著重要作用[8,9]，細胞因子網(wǎng)絡和細胞因子失衡在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。RA發(fā)病過程中細胞免疫亢進，Th1細胞介導分泌TNF-α、IL-1β和IFN-γ大量增多，TNF-α和IL-6是類風濕關節(jié)炎致病過程中的兩個重要細胞因子，在激活滑膜細胞引起關節(jié)受損及誘導炎癥過程中起重要作用，TNF-α可誘導滑膜細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，刺激滑膜細胞與軟骨細胞合成膠原酶，引起并增強炎癥反應。同時TNF-α的大量產(chǎn)生可以促進破骨細胞的生成，在RA的發(fā)病中起作用[10,11]。IL-6大量存在于RA患者的血清和關節(jié)液中,其濃度與RA的嚴重程度有關。IL-6能促進T細胞和B細胞的增殖和活化，促進類風濕因子和其他細胞因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)急性期反應蛋白的表達[12]。促炎性Th1細胞及其分泌的特征性細胞因子IFN-γ和抗炎性Th2細胞及其分泌的細胞因子的失衡是RA發(fā)病的重要機制。IFN-γ與單核細胞激活相關，可誘發(fā)組織損傷和炎癥反應，導致軟骨降解，促進滑膜成纖維細胞增殖。本研究觀察了FNS007對CIA大鼠血清中炎性細胞因子的影響，結果顯示，F(xiàn)NS007有效抑制CIA大鼠體內(nèi)TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌，從而抑制了細胞因子的促炎效應,說明FNS007可能通過抑制Th1優(yōu)勢應答而達到治療效果。約60%RA患者的血清中存在著抗CⅡ抗體,抗CⅡ抗體不僅是致病因素，也是疾病發(fā)展的生物標志物，在RA發(fā)病中起著重要作用。本研究顯示FNS007明顯降低CIA大鼠血清抗CⅡ抗體的產(chǎn)生。FNS007的治療性給藥有效調(diào)節(jié)了異常免疫反應并減少所產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，減輕CIA大鼠的炎癥癥狀、抑制踝關節(jié)腫脹、軟組織損傷及后期骨破壞，對大鼠CIA具有明顯的治療效果。

目前治療RA的藥物共分為五代：第一代是非甾體類抗炎藥物；第二代是糖皮質(zhì)激素；第三代是改變病情藥(慢作用抗風濕藥)；第四代是以TNF-α抑制劑為主的早期生物制劑；第五代為直接針對T細胞發(fā)生作用的新型生物制劑。FNS007是針對T細胞功能的生物制劑?？乖せ頣細胞需要兩種信號，第一信號為T淋巴細胞與抗原提呈細胞之間的作用；即TCR-Ag-HLA-DR三分子復合物的形成,細胞表面協(xié)同刺激分子提供第二信號。FNS007將CⅡ肽中與T細胞受體結合的氨基酸替換，保留與HLA-DRB1結合的氨基酸，可競爭性結合抗原提呈細胞表面的HLA-DRB1，抑制自身抗原與之結合，從而抑制TCR-Ag-HLADR三分子復合物的形成，從而抑制由HLA-DRB1介導的T細胞激活及自身免疫反應以及由此引起的炎癥介質(zhì)釋放等病理過程。

綜上所述，新型生物制劑FNS007對CⅡ誘導的大鼠膠原性關節(jié)炎有明顯抑制作用，其機制為FNS007作用于CIA發(fā)病的起始環(huán)節(jié)，抑制T細胞活化，從而抑制抗體和致炎性細胞因子的分泌，減輕組織損傷和骨破壞，對關節(jié)炎起到治療作用，這為該藥應用于臨床治療類風濕關節(jié)炎及其他T細胞介導的自身免疫病提供了實驗依據(jù)。

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[收稿2017-03-27]

(編輯 倪 鵬)

Effectsofnon-Tcellbindingpeptide(FNS007)oncollagenⅡ-inducedarthritisratmodels

LILi-Ping，LIUChao，XIELi-Jun，HUANGLi-Jing，HAONa，GELan，YANShao-Feng，LIGuo-Feng，XUXiao-Hong，ZHANGQin-Zeng，LILan-Fang，JIANGHong，ZHANGJian-Xin.

InstituteofMateriaMedical,HebeiCentersforDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050021,China

Objective:To observe the effects of FNS007 on collagen Ⅱ- induced arthritis(CIA) rat models and investigate the underlying mechanism.Methods: CIA model was induced by intradermal injection of Freunds adjuvant and bovine CⅡ.Rats were randomly divided into six groups:normal control group,model group,methotrexate group,high,middle and low doses of FNS007 groups,with 12 rats in each group.FNS007 was gived by intravenous injection,the normal control and model group were administrated with PBS.Observing the paw thickness,ankle joint width and the arthritis scores in the CIA rats during the experiment.On d 22 after injection of the drug， all rats were killed.Interferon-γ(IFN-γ),tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-6 (IL-6) and level of anti-CⅡantibody in serum were examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The pathological score and radiography of ankle joint were evaluated.Results: Data revealed that FNS007 treated groups showed a significant reduction in paw thickness,ankle joint width and the arthritis scores compared to model group (P<0.05,P<0.01),especially FNS007 high dose goup.The levels of TNF-α,IFN-γ,IL-6 and anti-CⅡantibodies in serum in high dose goup were significantly lower than those of model group(P<0.05,P<0.01).X-ray examination showed that FNS007 could significantly alleviate the damage of joint and decrease the radiographic scores.Pathological examination exhibited that FNS007 could significantly reduce pathological scores,alleviate inflammatory cell infiltration and synovial hyperplasia,improve the histopathological changes.Conclusion: FNS007 has a treating effect on CIA rats,and the mechanisms may be through competitive inhibition of T cell,inhibiting inflammatory cytokines and anti-CⅡantibodies secretion,regulating the abnormal immune responses.

Non-T cell binding peptide(FNS007); Collagen-induced arthritis;Rheumatoid arthritis；Rat

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.022

①本文為河北省重大醫(yī)學科研課題資助項目(No.zd2013069)和河北省科技支撐計劃項目(No.14272608D)。

李立萍(1975年-)，女，博士，副研究員，主要從事心腦肺血管和抗炎免疫藥理學方面研究，E-mail:lilip2006@163.com。

及指導教師：張建新(1952年-)，男，博士,教授,博士生導師,主要從事心腦肺血管和抗炎免疫藥理學方面研究,E-mail:zhangjx100@163.com。

R392

A

1000-484X(2017)09-1381-05

②河北菲尼斯生物技術有限公司，石家莊050035。