王高峰 李月靈 彭 紅 李慧川

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，鄭州450063)

長鏈非編碼CDKN2B調(diào)控miR-19對慢性髓細(xì)胞白血病的影響①

王高峰 李月靈 彭 紅 李慧川②

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，鄭州450063)

目的：探討長鏈非編碼CDKN2B調(diào)控miR-19的表達(dá)影響慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞的生物學(xué)行為的方式及其機(jī)制。方法：qPCR檢測不同白血病細(xì)胞中CDKN2B的表達(dá)情況；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測CDKN2B與miR-19的相互作用；MTT增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞檢測CDKN2B對HL-60細(xì)胞增殖和凋亡的影響；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測沉默CDKN2B后白血病HL-60細(xì)胞遷移能力的變化；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測沉默CDKN2B后白血病HL-60細(xì)胞侵襲能力的變化；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測沉默CDKN2B后miR-19對HL-60細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；鬼筆環(huán)肽染色檢測沉默MEG3后細(xì)胞骨架微絲微管形態(tài)變化；Western blot檢測沉默CDKN2B后PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：在HL-60細(xì)胞中CDKN2B表達(dá)水平最低；CDKN2B能與miR-19的3′UTR特異性結(jié)合；過表達(dá)CDKN2B可以抑制HL-60細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)其凋亡行為；沉默CDKN2B可以增強(qiáng)白血病HL-60細(xì)胞侵襲和遷移能力；過表達(dá)CDKN2B后細(xì)胞骨架表現(xiàn)為偽足減少，運(yùn)動(dòng)能力減弱；肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平下調(diào)；過表達(dá)CDKN2B后PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)情況相應(yīng)下調(diào)。結(jié)論：CDKN2B可以靶向調(diào)節(jié)miR-19調(diào)控白血病細(xì)胞生物學(xué)行為。

CDKN2B；白血??；miR-19； 鬼筆環(huán)肽

慢性髓細(xì)胞白血病是血液惡性腫瘤中發(fā)病率較高的腫瘤類型，其發(fā)病率和死亡率在血液系統(tǒng)腫瘤中都處于較高水平[1]。雖然近年來白血病的篩查和診治方面的進(jìn)展較快，提高了白血病患者的預(yù)期壽命，但是一旦白血病細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其預(yù)后仍較差[2]。因此探討白血病的分子靶向基因治療對提高白血病的早期診斷率十分重要。

CDKN2B可以編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，可在骨髓細(xì)胞和巨核細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)選擇性表達(dá)的狀態(tài)[3]。 CDKN2B的異常表達(dá)和慢性髓細(xì)胞白血病的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)，可能是誘導(dǎo)髓細(xì)胞突變的獨(dú)立調(diào)控因素[4]。表觀遺傳學(xué)研究也表明CDKN2B基因沉默是白血病分子治療方向的可能靶標(biāo)[5]。

微小RNA(miRNA)是一種非編碼的短單鏈RNA，可以通過結(jié)合其3′非翻譯區(qū)來調(diào)控多個(gè)靶基因的功能，誘導(dǎo)靶向miRNA的直接降解或翻譯抑制過程[6]。較多研究表明，通過調(diào)控致癌基因和腫瘤抑制基因的表達(dá)水平可以將miRNA表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程聯(lián)系起來[7]。此外，miRNA的基因調(diào)控與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，miRNA與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移相關(guān)[8,9]。這些miRNA的表達(dá)變化是診斷和治療髓細(xì)胞白血病的可能治療靶點(diǎn)，因?yàn)槊糠NmiRNA影響下游多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，對白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的影響是十分復(fù)雜且關(guān)鍵的[10]。

在本研究中，我們探討CDKN2B的異常表達(dá)對慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲行為的調(diào)控情況，并通過探討其下游miR-19分子的變化，研究其對髓細(xì)胞白血病細(xì)胞抑制作用的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系和試劑 原代髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株KG-1、HL-60、KU812和THP-1由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院細(xì)胞研究所提供。細(xì)胞培養(yǎng)條件：所有細(xì)胞株在RPMI1640培養(yǎng)基，含有10%FBS，100 mg/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，37℃在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。ROCK、RhoA、p-PI3K、p-AKT和mTOR抗體均購于美國Abcam公司(ab45171、ab54835、ab182651、ab38449、ab32028)。

1.2方法

1.2.1miR-19慢病毒病毒感染 通過慢病毒轉(zhuǎn)染獲得過表達(dá)miR-19的細(xì)胞，將編碼miR-19或空載體的慢病毒感染到HL-60細(xì)胞中。并根據(jù)制造商的說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)將其轉(zhuǎn)染入細(xì)胞48 h，通過GFP表達(dá)選擇具有穩(wěn)定miR-19表達(dá)的克隆細(xì)胞株。

1.2.2qPCR實(shí)驗(yàn) 使用Trizol(Invitrogen)從HL-60細(xì)胞系提取總RNA，并通過測量其在260 nm處的吸光度來定量測定總RNA的濃度。使用SYBRH Green PCR Kit進(jìn)行qPCR分析。miR-19和U6的引物(內(nèi)部對照)購自QIAGEN。 使用RQ=2-ΔΔCT方法計(jì)算miRNA的倍數(shù)變化。通過qPCR測定白血病細(xì)胞株中的相對miRNA水平，使用GAPDH作為內(nèi)部對照引物。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。CDKN2B的前體序列如下：(正向)5′-CTATGTTTGAATAATTCCAG-3′和(反向)5′-CGCGTCGCCGCGUUAAGAAC-3′。

1.2.3雙熒光素酶報(bào)告基因 驗(yàn)證CDKN2B和miR-19的相關(guān)關(guān)系，我們使用雙熒光素酶測定，將24孔板中的CDKN2B或NC細(xì)胞與0.4 mg螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體和0.08 mg含有海腎螢光素酶(Promega)的pRL-TK對照載體共轉(zhuǎn)染，按照使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報(bào)告基因測定系統(tǒng)(Promega)測量熒光素酶活性。將螢火蟲熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化后測定海腎螢光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4MTT增殖實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)期HL-60細(xì)胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸浮液并以1×103細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。 在細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，加入20 μl MTT測定液，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在24、48、72和96 h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)測定波長為490 nm時(shí)的吸光度，計(jì)算白血病細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) (1)實(shí)驗(yàn)前約24 h，接種兩瓶HL-60細(xì)胞，標(biāo)記①、②，每瓶含約6 ml培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(2)實(shí)驗(yàn)前約2.5 h，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%，①號(hào)瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml，②號(hào)瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h。(3)染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入HO 33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15 min。 (4)滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10 μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細(xì)胞，并統(tǒng)計(jì)三者比例，計(jì)算凋亡率。

1.2.6劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將HL-60細(xì)胞(48 h)進(jìn)行胰蛋白酶消化，并將適量細(xì)胞平鋪在6孔板上。使用200 μl無菌槍頭輕劃孔板，每個(gè)孔劃4～5次，盡量保證所劃線處于平行狀態(tài)，放置37℃恒溫細(xì)胞培育箱，在24、48、72 h后，分別用適量PBS沖洗孔板，顯微鏡下觀察HL-60細(xì)胞遷移的距離。然后對比兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 通過Transwell對HL-60細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行測定。將HL-60細(xì)胞在含有0.1%FBS的DMEM中培養(yǎng)。 24 h后，將2×105個(gè)饑餓過的HL-60細(xì)胞接種在上室中，將具有10%FBS和HGF(20 ng/ml)的培養(yǎng)基置于下室中。在37℃下孵育24 h后，小心地擦去上室膜表面的細(xì)胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈過后，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架形態(tài)變化 制作HL-60細(xì)胞爬片；24 h后4%多聚甲醛固定15 min，0.5%Triton X-100/PBS在室溫下孵育破膜10 min；1 μl FITC-Phallodin儲(chǔ)存液加入50 μl PBS中配成工作液，用以染色細(xì)胞骨架，在室溫下孵育40～60 min，完全清洗后吸去多余水分，加熒光封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9Western blot實(shí)驗(yàn) 用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與一抗(濃度1∶1 000)，內(nèi)參GAPDH(濃度1∶2 000)，4℃，孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根酶標(biāo)記物(濃度1∶2 000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影液檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 16.0軟件包(SPSS，Chicago，IL)進(jìn)行，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析CDKN2B在白血病細(xì)胞中的差異表達(dá)。采用最小差別t檢驗(yàn)分析兩組。

2 結(jié)果

2.1qPCR檢測不同慢性髓細(xì)胞中CDKN2B的表達(dá) qPCR結(jié)果表明：(圖1 A)與其他細(xì)胞株相比，HL-60細(xì)胞中CDKN2B mRNA表達(dá)水平明顯降低[(0.18±0.02)vs(0.75±0.04),P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)合以上結(jié)果，考慮CDKN2B在白血病中起抑癌作用，我們挑選HL-60為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。圖1B顯示，使用慢病毒LV5-CDKN2B轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染效率高于80%。qPCR也顯示慢病毒轉(zhuǎn)染后CDKN2B的表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。

2.2雙熒光素酶檢測CDKN2B和miR-19之間的關(guān)聯(lián) 為明確與CDKN2B相關(guān)的miRNA的情況，我們使用生物信息學(xué)預(yù)測工具，為明確與CDKN2B相關(guān)的miRNA的情況，我們使用生物信息學(xué)預(yù)測工具，發(fā)現(xiàn)CDKN2B和miR-19有相似的結(jié)合位點(diǎn)序列，為了驗(yàn)證CDKN2B能否與miR-19 3′UTR結(jié)合，我們將LV5-CDKN2B與miR-19共轉(zhuǎn)染到白血病細(xì)胞293U中。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示(圖2A、B)：LV5-CDKN2B可以明顯抑制miR-19的熒光素酶活性。結(jié)果表明，LV5-CDKN2B能與miR-19的3′UTR特異性結(jié)合。

2.3CDKN2B的表達(dá)對慢性髓細(xì)胞HL-60增殖和凋亡的影響 為了研究CDKN2B對HL-60細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示，與NC對照組相比，LV5-CDKN2B組的細(xì)胞的增殖速度明顯降低[(0.856±0.089)% vs (0.215±0.025)%,P=0.028]，培養(yǎng)60 h后的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比NC組，LV5-CDKN2B組的HL-60細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加[(82.32±8.62)% vs(15.24±1.56)%,P<0.05]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。綜上所述，過表達(dá)CDKN2B后可以明顯抑制HL-60細(xì)胞株的增殖能力，促進(jìn)其凋亡行為。

圖1 qPCR檢測CDKN2B的表達(dá)水平Fig.1 Expression level of CDKN2B was detected by qPCRNote: A.qPCR detection of CDKN2B expression in different cell lines；B.Immunofluorescence was used to detect lentivirus transfection efficiency；C.qPCR was used to detect the expression of CDKN2B after lentivirus transfection.*.P<0.05.

圖2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測CDKN2B和miR-19之間的關(guān)系Fig.2 Double luciferase assay to detect relationship between CDKN2B and miR-19Note: A.Binding site of CDKN2B to miR-19；B.double luciferase to detect the relationship between CDKN2B and miR-19.

2.4CDKN2B的表達(dá)對HL-60細(xì)胞遷移和侵襲的影響 通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CDKN2B對HL-60細(xì)胞株遷移情況的影響。LV5-CDKN2B組的細(xì)胞的遷移速率比其對照組明顯下調(diào)[24 h(25.62±3.64)% vs (13.65±2.06)%，P=0.025；48 h(50.68±5.06)%vs (24.98±3.28)%，P=0.038；72 h(83.86±7.95)%vs (47.26±5.69)%，P=0.008)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A)。過表達(dá)CDKN2B后可以明顯抑制HL-60細(xì)胞株的遷移能力。如圖4B所示，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測CDKN2B對HL-60細(xì)胞株侵襲情況的影響。LV5-CDKN2B組的細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目比其對照組明顯減少[(86.9±10.2) vs (18.6±1.9),P=0.011]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，過表達(dá)CDKN2B后可以明顯抑制HL-60白血病細(xì)胞株的遷移和侵襲能力。

2.5CDKN2B對HL-60細(xì)胞骨架形態(tài)及功能的影響作用 細(xì)胞骨架鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示(圖5A)：與NC對照組相比，LV5-CDKN2B組HL-60細(xì)胞F-actin染色明顯減少，細(xì)胞膜褶皺形成減少，胞漿內(nèi)偽足數(shù)目明顯減少。

圖3 CDNK2B對HL-60細(xì)胞增殖和凋亡行為的影響Fig.3 Effect of CDKN2B on proliferation and apoptosis of HL-60 cellsNote: A.MTT assay to detect the proliferation of HL-60 cells；B.Flow cytometry was used to detect the apoptosis behavior of HL-60 cells.

Western blot結(jié)果顯示(圖5B)：與NC組相比，LV5-CDKN2B組中的ROCK和RhoA蛋白激酶的表達(dá)水平明顯下調(diào)[ROCK(79.52±5.91)% vs(13.26±4.24)%,P<0.05；RhoA(82.19±11.25)% vs (19.66±8.2)%,P<0.05]。表明過表達(dá)CDKN2B的表達(dá)后可以下調(diào)ROCK和RhoA蛋白激酶的水平。

圖4 CDKN2B對HL-60細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.4 Effects of CDKN2B on migration and invasion of HL-60 cellsNote: A.Scratch healing test to detect changes in migration capacity of HL-60 cells；B.Transwell invasion assay to detect the invasion of HL-60 cells.*.P<0.05.

圖5 CDKN2B對HL-60細(xì)胞骨架和肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of CDKN2B on cytoskeleton and actin expression in HL-60 cellsNote: A.Phalloidin staining to detect HL-60 cytoskeleton morphological changes;B.Western blot was used to detect the expression of actin family protein.*.P<0.05.

圖6 CDKN2B對PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of CDKN2B on PI3K/AKT signaling pathway protein expressionNote: *.P<0.05.

2.6CDKN2B的表達(dá)對PI3K/AKT信號(hào)通路的激活作用 我們探討CDKN2B調(diào)控HL-60細(xì)胞的生物學(xué)行為是否和PIK3/AKT信號(hào)通路相關(guān)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)CDKN2B之后PIK3/AKT信號(hào)通路中的p-PI3K、p-AKT和mTOR蛋白表達(dá)相應(yīng)下調(diào)[(77.3±6.34)% vs (20.2±1.76)%，(125.7±14.67)% vs (31.36±3.06)%，(88.3±6.95)% vs (22.2±2.18)%，P=0.016]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。說明過表達(dá)CDKN2B后HL-60細(xì)胞的生物學(xué)行為的改變可能是通過PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控的。

3 討論

慢性骨髓性白血病(CML)最初是在20世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)的，在一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展過程中，其治療方面的進(jìn)展未取得明顯的進(jìn)步[11]。目前主要靠放射治療和多種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用以提高患者生活質(zhì)量，延長患者的生存期。但是目前最根本的治療方案仍是骨髓抑制，但是其副作用也是相當(dāng)明顯的，所以尋求新的分子治療方案是目前亟待解決的問題。之前有相關(guān)實(shí)驗(yàn)通過比較基因組間的雜交分型和分子遺傳分析顯示在慢性髓細(xì)胞白血病中，CDKN2B基因廣泛存在，但是，也有不足10%的白血病患者中存在CDKN2B的缺失[12]。有研究報(bào)道，CDKN2B是通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶Cdk4和Cdk6的活性而起到調(diào)節(jié)作用[13]。CDNK2B的產(chǎn)物通過結(jié)合Mdm2，進(jìn)而抑制Mdm2介導(dǎo)的抑癌基因p53的降解來調(diào)節(jié)腫瘤抑制蛋白的活性，CDKN2B屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的基因家族，其在細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用是極其重要的[14,15]。該家族的其他成員還有CDKN2A、CDKN2C和CDKN2D，CDKN2A和CDKN2B是眾所周知的腫瘤抑制基因，其在各種類型的人類腫瘤中都存在表達(dá)異常的狀況[16,17]。CDKN2C基因的突變也在人類腫瘤中有過報(bào)道，但相比CDKN2B作用就相對較小。

我們發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)慢性髓細(xì)胞白血病中CDKN2B的表達(dá)缺失情況是非常常見的[18]。在HL-60白血病細(xì)胞模型中CDKN2B與下游相關(guān)miRNA存在顯著的相關(guān)性。我們觀察到與其他類型白血病細(xì)胞株相比，HL-60細(xì)胞中CDKN28的表達(dá)情況下調(diào)明顯，且通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測到，CDKN2B和miR-19之間存在上下游調(diào)節(jié)關(guān)系，即CDKN2B可以影響miR-19的活性，從而調(diào)控miR-19對白血病細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。

miR-19參與多種人類癌癥的發(fā)生和進(jìn)展過程，是目前研究較為熱門的miRNA之一。不僅涉及促進(jìn)腫瘤生長、增殖、抗細(xì)胞凋亡等過程，甚至可以對腫瘤細(xì)胞的分化、復(fù)發(fā)及耐藥性有一定的調(diào)控作用[19,20]。但是不同的研究表明miR-19在不同的腫瘤類型中扮演的角色不同，多數(shù)情況下扮演一個(gè)促癌miRNA的角色[21]。Wong等[22]在乳腺癌芯片中發(fā)現(xiàn)，miR-19在絕大部分芯片中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。而Landais[23]也發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在100余種miRNA表達(dá)異常，而miR-19是相對表達(dá)異常的一種miRNA。然而在慢性髓細(xì)胞白血病患者中，尚未有研究明確指出miR-19的具體表達(dá)和相關(guān)作用。

令人感興趣的是，在以往的研究中，CDKN2B盡管表現(xiàn)出明顯的抑癌作用，但是鮮有學(xué)者進(jìn)行深一步的研究繼續(xù)探討，對CDKN28的具體作用機(jī)制都涉足不多。有研究表明，CDKN2B的表達(dá)增高，可以導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱。Mohseny等[24]研究表明，CDKN2B的表達(dá)水平與骨肉癌的分級(jí)分期有關(guān)，并且CDKN2B與骨肉瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移范圍呈一定相關(guān)關(guān)系。本研究通過沉默CDKN2B的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力變強(qiáng)，細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，結(jié)合前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明CDKN2B在髓細(xì)胞白血病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。本研究通過生物信息學(xué)分析證實(shí)，CDKN2B與miR-19有直接相互作用，進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)，CDKN2B可與miR-19的 3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，表明CDKN2B可以調(diào)控miR-19的表達(dá)從而激活下游相關(guān)因子的活性。

本研究通過使用qPCR檢測CDKN2B和miR-19在慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株中的表達(dá)情況，同時(shí)進(jìn)一步探討CDKN2B與miR-19的相互作用關(guān)系，并驗(yàn)證CDKN2B與miR-19在HL-60細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程中的作用，證實(shí)CDKN2B可用通過影響白血病HL-60細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過PI3K/AKT信號(hào)通路對白血病細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為進(jìn)行干擾。間接表明PI3K/AKT信號(hào)通路在CDKN2B調(diào)控miR-19影響白血病細(xì)胞生物學(xué)功能的過程中起到一定作用。提示CDKN2B可能參與白血病細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程，為慢性髓細(xì)胞白血病的診治、預(yù)后和監(jiān)測治療效果提供一定的理論支持。

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[收稿2017-04-19]

(編輯 倪 鵬)

Effectoflong-chainnon-codingCDKN2BonmiR-19inchronicmyeloidleukemia

WANGGao-Feng,LIYue-Ling,PENGHong,LIHui-Chuan.

MedicalSchoolofYellowRiverInstituteofScienceandTechnology,Zhengzhou450063,China

Objective:To investigate the effect of long-chain non-coding CDKN2B targeting miR-19 on the biological behavior of chronic myeloid leukemia cells and its mechanism.Methods: The expression of CDKN2B in different leukemia cells were detected by qPCR.Double luciferase reporter gene was used to detect the interaction between CDKN2B and miR-19.MTT proliferation assay and flow cytometry were used to detect the effect of CDKN2B on the proliferation and apoptosis of HL-60 cells.The changes of migration ability of leukemia HL-60 cells after overexpress of CDKN2B were detected by scratch test.The changes of invasion ability of leukemia HL-60 cells after silencing CDKN2B were detected by Transwell invasion assay.Scaling healing experiment and Transwell invasion assay were used to detect the effect of miR-19 on the migration and invasion of leukemia cells after silencing CDKN2B.The morphological changes of cytoskeleton microfilament microtubules after silencing CDKN2B were detected by phalloidin staining.Western blot was used to detect the expression of PI3K/AKT signaling pathway after silencing CDKN2B.Results: The expression level of CDKN2B was the lowest in leukemia cell HL-60.CDKN2B binds specifically to the 3′UTR of miR-19;overexpression of CDKN2B could inhibit the proliferation and enhance the apoptosis of leukemia HL-60 cells.Overexpression of CDKN2B can inhibit the invasion and migration of leukemia HL-60 cells.After overexpressed of CDKN2B,the cytoskeleton showed decreased pseudopodia and decreased exercise capacity.The expression of actin was down-regulated.The expression of PI3K/AKT pathway protein was down-regulated after overexpressed of CDKN2B.Conclusion: CDKN2B can target the regulation of miR-19 to regulate the biological behavior of leukemia cells.

CDKN2B;Leukemia;miR-19;Phalloidin

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.021

王高峰(1975年-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師(工程師)，主要從事藥劑學(xué)方面研究,E-mail：cassssi@sina.com。

R733.7

A

1000-484X(2017)09-1375-06

①本文為河南省教育廳重點(diǎn)研究項(xiàng)目(15B350003)。

②鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，鄭州450052。