韋傳寶 鄧 輝

(皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，六安237012)

檢測(cè)侵染生姜的煙草花葉病毒ELISA的建立①

韋傳寶 鄧 輝

(皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，六安237012)

目的：建立檢測(cè)侵染生姜的煙草花葉病毒的ELISA方法。方法：用RT-PCR方法檢測(cè)侵染生姜的煙草花葉病毒，挑選僅含煙草花葉病毒的生姜葉片，采用離心方法提取葉片中的煙草花葉病毒，通過12% SDS-PAGE 和5%～20%梯度SDS-PAGE二次制備電泳分離出煙草花葉病毒的外殼蛋白CP，將含CP的聚丙烯酰胺凝膠磨細(xì)后免疫小鼠，獲得抗血清。用Western blot檢測(cè)抗血清特異性，ELISA檢測(cè)抗血清的結(jié)合性，通過親和層析純化抗血清中的IgG。以待測(cè)生姜葉片液為抗原包被，純化的抗血清IgG為一抗，羊抗小鼠 IgG為二抗，建立檢測(cè)侵染生姜的煙草花葉病毒的間接ELISA。結(jié)果：抗血清中的IgG僅僅與煙草花葉病毒的CP結(jié)合，并能夠結(jié)合天然煙草花葉病毒顆粒。建立的ELISA對(duì)花葉病生姜葉片的檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論：成功地建立了檢測(cè)侵染生姜的煙草花葉病毒的ELISA方法。

煙草花葉病毒；生姜；ELISA方法

生姜(Zingiber officinale Rosc.)為姜科姜屬多年生宿根草本植物，是集調(diào)味品、食品加工原料和藥用為一體的蔬菜。我國是生姜生產(chǎn)和出口大國，隨著生姜種植面積擴(kuò)大，病毒性感染日趨嚴(yán)重。在全世界范圍內(nèi)，煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是侵染生姜并引起嚴(yán)重危害的病毒之一[1]。由于生姜采用無性繁殖，感染病毒逐年積累，危害也逐年加重，病毒病可導(dǎo)致生姜減產(chǎn)30%～50%，且影響品質(zhì)[2]。目前還沒有防治生姜病毒病的有效藥物，解決病毒病的途徑是通過適當(dāng)?shù)姆椒êY選出無病毒生姜進(jìn)行繁育，建立種子基地，用無病毒良種栽培。

TMV是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的代表種，人們對(duì)TMV的研究已經(jīng)有一個(gè)多世紀(jì)。TMV世界性分布，其寄主范圍十分廣，除危害煙草外，可侵染包括姜科、茄科、葫蘆科等36科共310種植物。侵染生姜的TMV株系與侵染煙草的TMV基因組序列也有較大的差別[3]。TMV侵染后生姜的癥狀為花葉、斑塊狀褪綠或者黃化，苗期感染導(dǎo)致植株矮化，發(fā)病后期可產(chǎn)生壞死斑點(diǎn)。TMV基因組由1個(gè)單鏈、正性RNA組成，全長6 395 bp，有4個(gè)開放閱讀框(ORF)，第四個(gè)ORF編碼了一個(gè)17.6 kD的外殼蛋白(CP)。

雖然檢測(cè)植物病毒的方法有多種，但間接ELISA法是最方便的方法，而且成本也低，每次可以檢測(cè)幾十乃至上百個(gè)樣品，是一種經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法[4]。由于目前還沒有建立能檢測(cè)侵染生姜 的ELISA方法，脫毒生姜種苗的質(zhì)量多通過目測(cè)或者指示植物方法確定，既缺乏科學(xué)性又費(fèi)時(shí)[5]。本研究建立檢測(cè)侵染生姜煙草花葉病毒的ELISA方法，有利于生姜病毒感染的檢出。

1 材料與方法

1.1材料 Protein A-Red Sepharose(High Capaci-ty)購自BIOWORD公司；SDS-PAGE Middle Range Protein Molecular Weight Standards購自Gibco公司；GeneRulerTM1 kb DNA Ladder和病毒基因組提取試劑盒購自 MBI公司；羊抗小鼠 IgG(堿性磷酸酶共價(jià)結(jié)合)、4-硝基苯基磷酸二鈉(p-NPP)、5-溴-4氯-3吲哚磷酸 (BCIP)和氮藍(lán)四唑 (NBT)購自Sigma公司，分子量標(biāo)準(zhǔn)品；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1煙草花葉病毒的RT-PCR檢測(cè) 侵染生姜的煙草花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)按照劉金亮等[6]的方法進(jìn)行，大致程序是：用試劑盒提取病毒基因組，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用合成的引物PCR擴(kuò)增CP基因，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2煙草花葉病毒單獨(dú)侵染生姜葉片的獲取 要制備侵染生姜的煙草花葉病毒的抗體，必須提取該病毒，因此必須獲取大量由煙草花葉病毒單獨(dú)侵染生姜病葉的葉片，為此，我們?cè)谏耘鄥^(qū)——六安市舒城縣尋找大田栽培有花葉病癥狀的生姜，采集葉片進(jìn)行煙草花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)確定單獨(dú)被煙草花葉病毒侵染的大田，大量采集生姜病葉，超低溫冰箱保存待用。

1.2.3從生姜葉片中提取煙草花葉病毒顆粒 按照韋傳寶博士論文中使用的方法提取煙草花葉病毒顆粒，步驟如下：①勻漿 100 g病葉加400 ml預(yù)冷的0.5 mol/L磷酸鉀緩沖液 (pH7.0,含0.1%巰基乙醇,0.01 mol/L EDTA)，用均漿器均漿，雙層紗布過濾獲得葉汁。②去除葉綠素葉汁加入1/4體積的CCl4，劇烈攪拌5 min后，6 000 r/min離心20 min，去除沉淀的葉綠素，獲得上清液。③病毒的初步沉淀 上清液加入0.1% Triton X-100，6% PEG6000，3% NaCl，攪拌30 min后，靜置6 h。然后8 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀含病毒顆粒。④病毒的懸浮 沉淀用20 ml 0.5 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0,含0.1%巰基乙醇,0.001 mol/L EDTA,0.5 mol/L尿素)懸浮后，8 000 r/min離心10 min，保留上清，沉淀再重復(fù)1次懸浮處理，合并二次上清液，棄沉淀，上清液含病毒顆粒。⑤病毒的超速離心沉淀 將上清液加到含10 ml 20%蔗糖墊的離心管上層，90 000 r/min離心90 min,棄上清液，沉淀含病毒顆粒。⑥病毒懸浮液獲得 沉淀用2 ml蒸餾水懸浮，10 000 r/min離心5 min，上清液為病毒懸浮液，保留上清液，棄沉淀。

1.2.4提取后的病毒顆粒懸浮液的檢測(cè) 提取的煙草花葉病毒顆粒懸浮液加2×SDS上樣緩沖液,充分裂解后置100℃水浴加熱10 min,離心(9 000 r/min)7 min,吸取上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)電泳,電泳后染色觀察，如果病毒提取成功，在電泳圖上17.6 kD處將會(huì)出現(xiàn)一個(gè)煙草花葉病毒CP蛋白條帶。

1.2.5煙草花葉病毒外殼蛋白的提取 為了制備高純度CP蛋白,采取2次制備電泳的方法純化煙草花葉病毒外殼蛋白,第一次用12% SDS-PAGE制備電泳,第二次用5%～20%梯度SDS-PAGE制備電泳。取0.8 ml提取的煙草花葉病毒懸浮液，加0.8 ml 2×SDS上樣緩沖液,充分裂解后置100℃水浴加熱10 min,離心 (9 000 r/min)7 min,吸取上清液進(jìn)行電泳。電泳完畢后,將凝膠置0.25 mol/L KCl 4℃染色 0.5 h,切下煙草花葉病毒外殼蛋白目的條帶放入研缽磨細(xì),加1.6 ml 1×SDS上樣緩沖液萃取,離心后取上清液(含外殼蛋白)加入5%～20%梯度SDS-PAGE電泳槽進(jìn)行第2次制備電泳。電泳完畢后,將凝膠置0.25 mol/L KCl 4℃染色0.5 h,切下主蛋白目的條帶,分成4份，-30℃下保存。

1.2.6抗煙草花葉病毒血清的制備 將含煙草花葉病毒外殼蛋白的聚丙烯酰胺凝膠磨細(xì)后直接免疫小鼠，免疫過程大致如下：取1份含目的蛋白的凝膠和2 ml生理鹽水于研缽充分研磨,注射4只小鼠(重18～22 g),第一次注射為腹腔和皮下兩點(diǎn)注射，每個(gè)點(diǎn)注射0.25 ml磨細(xì)的樣品懸浮液，后面3次注射都是1點(diǎn)腹腔注射，注射量0.5 ml。兩次注射時(shí)間相隔7 d,第4次注射后第3天斷頭取血,離心收集血清。

1.2.7Western blot分析抗血清特異性 特異性是抗血清質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于本研究而言，要求制備的抗血清中IgG僅僅與煙草花葉病毒的CP結(jié)合，與其他病毒蛋白質(zhì)或者植物蛋白不結(jié)合。特異性的測(cè)定采用Western blot法[7]，將純化的煙草花葉病毒進(jìn)行12% SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜，一抗為制備的抗血清,二抗為與堿性磷酸酶共價(jià)結(jié)合的羊抗小鼠 IgG,BCIP/NBT顯色，將符合條件的抗血清保存?zhèn)溆?其他血清棄之。

1.2.8ELISA檢測(cè)抗血清結(jié)合性 制備的抗血清中的IgG要與天然煙草花葉病毒顆粒的外殼蛋白結(jié)合才能夠用于檢測(cè)病葉中的煙草花葉病毒。結(jié)合性是抗血清質(zhì)量的另一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于本研究而言，要求制備的抗血清中IgG能夠結(jié)合到天然煙草花葉病毒的外殼蛋白上。結(jié)合性的測(cè)定采用ELISA法[8]，將分離的煙草花葉病毒懸浮液用包被液稀釋，作為抗原包被到酶標(biāo)板孔內(nèi)，空白對(duì)照為包被液，制備的抗血清作為一抗與病毒顆?？乖Y(jié)合，二抗用1/10 000的羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶，加底物p-Npp顯色30 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD405nm。保留合格的抗血清，其他棄之。

1.2.9IgG純化 將合格的抗血清混合，測(cè)量抗血清體積，用(NH4)2SO4沉淀法除去大部分雜蛋白，初步提取抗血清中IgG。將IgG沉淀用緩沖液(0.01 mol/L Trs-HCl pH7.4)溶解并在緩沖液中透析去除大量的硫酸銨，然后使用對(duì)IgG有親和性的親和層析凝膠 Protein A Red Sepharose(Protein A 為親和配體)進(jìn)一步親和層析純化IgG,具體操作按照說明書進(jìn)行。親和層析洗脫后的IgG溶液經(jīng)濃縮、對(duì)PBS透析、再濃縮后與甘油按照 1∶1混合,-20℃保存。按照徐宜為[8]的間接 ELISA法測(cè)定混合抗體的效價(jià)。

1.2.10建立檢測(cè)TMV的ELISA 野外采集7塊大田栽培發(fā)生花葉病的生姜葉片，1塊健康的大田生姜葉片作為陰性對(duì)照(用RT-PCR確定未被TMV侵染)，共8個(gè)樣品。各取0.1 g干凈葉片加1.0 ml包被液于研缽進(jìn)行充分研磨，將葉汁轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管內(nèi)，3 000 r/min離心3 min，用上清液作為抗原包被酶標(biāo)板，包被過液，按照常規(guī)間接ELISA方法進(jìn)行操作[8]。制備的抗血清IgG作為一抗與病毒顆?？乖Y(jié)合，二抗用1/10 000的羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶，加底物p-Npp顯色30 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD405nm。按照常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)P/N(被測(cè)樣品孔吸光度值/陰性對(duì)照孔吸光度值)≥2.1判斷為陽性[8]，說明樣品孔含TMV病毒，比值越大說明病毒顆粒越多，比值低于2.1說明樣品孔無TMV病毒。對(duì)8個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行了RT-PCR方法檢測(cè)TMV，確定ELISA方法是否有效。

2 結(jié)果

2.1大田生姜病葉的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 按照劉金亮等[1]的方法；經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增侵染生姜的TMV的CP基因，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，從發(fā)病的生姜葉片中擴(kuò)增到約570 bp的目的片段，該片段包含煙草花葉病毒的CP基因，還有一段不表達(dá)的基因片段，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。該葉片未檢測(cè)出其他病毒的CP基因，因此發(fā)病田塊確定為僅僅被TMV侵染的生姜，對(duì)應(yīng)的病葉是本研究需要的病葉，大量采集備用。

2.2侵染生姜的TMV分離結(jié)果 提取的煙草花葉病毒顆粒12% SDS-PAGE 結(jié)果如圖2，在17.6 kD處有一個(gè)TMV的CP蛋白條帶，說明病毒提取成功。另一方面，從電泳圖中可以看出提取的病毒顆粒懸浮液中還含有其他蛋白雜質(zhì)，這些雜蛋白多數(shù)來自生姜葉片中的蛋白。這就是在純化煙草花葉病毒CP蛋白時(shí)，需要先通過12% SDS-PAGE制備電泳，然后再通過5%～20%梯度SDS-PAGE制備電泳進(jìn)一步純化的原因。5%～20%梯度SDS-PAGE制備電泳還具有分子篩分離功能，在12% SDS-PAGE制備電泳中分離不開的蛋白質(zhì)，在5%～20%梯度SDS-PAGE制備電泳中能完全分開。

圖1 侵染生姜的煙草花葉病毒CP基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification of TMV CP geneNote: M.Marker；1.TMV-CP.

圖2 提取的煙草花葉病毒懸浮液12% SDS-PAGEFig.2 12% SDS-PAGE for TMV suspensionNote: M.Protein marker;TMV.TMV suspension lane showing a CP band.

表18組抗血清的ELISA檢測(cè)結(jié)果

Tab.1ELISAtestresultsforeightgroupsantiserumagainstTMVparticle

AntiserumNo.1No.2No.3No.4No.5No.6No.7No.8OD405nm1.351.261.441.561.241.661.321.58P/N8.218.019.359.668.239.298.359.12Testresult++++++++

表2提取的IgG對(duì)大田生姜TMV的檢測(cè)及其與RT-PCR檢測(cè)的比較

Tab.2TestresultsofTMVusingTMVanti-IgGandcomparisonwithRT-PC

LeavesNegativeCKNo.1No.2No.3No.4No.5No.6No.7ELISAtest(P/N)1.255.324.831.125.335.044.565.11TMVRT-PCRtestnegativepositivepositivenegativepositivepositivepositivepositive

圖3 侵染生姜的煙草花葉病毒 CP抗血清的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of antiserum against TMV CPNote: M.Protein marker;1.Purified TMV particle;2.Healthy ginger leaf.

2.3抗血清的Western blot檢測(cè)結(jié)果 本研究制備了8組抗血清，每組平均4只小鼠，同組的小鼠抗血清合并作為一個(gè)抗血清樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。8組抗血清的Western blot檢測(cè)結(jié)果基本相同。圖3是其中一組抗血清的 Western blot分析圖,可以看出，制備的抗血清僅僅與CP特異性結(jié)合,與生姜葉片蛋白或者TMV其他蛋白無反應(yīng)。8組抗血清的Western blot檢測(cè)結(jié)果基本相同，說明該方法制備的抗血清質(zhì)量穩(wěn)定。

2.4抗血清的ELISA檢測(cè)結(jié)果 本研究制備了8組抗血清，每組平均4只小鼠，同組的小鼠抗血清合并作為一個(gè)抗血清樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。8組抗血清的檢測(cè)結(jié)果見表1。從表1數(shù)據(jù)可以看出8組抗血清的ELISA檢測(cè)結(jié)果基本相同，說明該方法制備的抗血清質(zhì)量穩(wěn)定。

2.5樣品的ELISA檢測(cè)結(jié)果 8組抗血清經(jīng)親和層析分離，洗脫后的IgG溶液經(jīng)濃縮、對(duì)PBS透析、再濃縮后獲得3.5 ml IgG溶液，與甘油按照1∶1混合獲得效價(jià) 1∶2 800的一抗。用大田生姜葉片的上清液作為抗原包，提取的IgG為一抗，羊抗小鼠 IgG為二抗，檢測(cè)7個(gè)樣品和1個(gè)陰性對(duì)照的TMV，并同時(shí)與RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果比較(表2)。

從表2可以看出，用本研究制備的IgG建立的間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果一致，說明本研究建立檢測(cè)侵染生姜TMV的ELISA方法的有效性和可靠性。

3 結(jié)論

本研究用采用離心提取病毒的方法成功提取了生姜葉片中的TMV；建立了12% SDS-PAGE和5%～20% 梯度SDS-PAGE二次制備電泳純化TMV外殼蛋白CP的方法。因制備電泳純化的煙草花葉病毒外殼蛋白包含在聚丙烯酰胺凝膠中，不需要將聚丙烯酰胺去除，外殼蛋白從網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中緩慢釋放到動(dòng)物體內(nèi)，抗原在動(dòng)物體內(nèi)停留時(shí)間長，充分刺激免疫系統(tǒng)，聚丙烯酰胺凝膠替代了昂貴的福氏佐劑。故本研究將含煙草花葉病毒外殼蛋白的聚丙烯酰胺凝膠磨細(xì)后直接免疫小鼠，成功制備出合格抗血清?？寡迥軌蛱禺惖亟Y(jié)合煙草花葉病毒CP蛋白，說明二次制備電泳獲得的CP蛋白非常純，不含其他雜蛋白。ELISA檢測(cè)說明抗血清中的IgG能夠與天然的TMV外殼蛋白結(jié)合，即血清中的IgG能夠結(jié)合天然TMV顆粒。通過親和層析純化出抗血清中的IgG,經(jīng)過濃縮、透析、與甘油混合獲得檢測(cè)TMV的抗體，成功建立了檢測(cè)侵染生姜TMV的ELISA方法，對(duì)其他植物病毒檢測(cè)也有借鑒意義。

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[收稿2017-03-06 修回2017-05-05]

(編輯 張曉舟)

EstablishmentofELISAmethodfortestingtobaccomosaicvirus(TMV)infectingZingiberofficinaleRosc

WEIChuan-Bao,DENGHui.

BiologicalandPharmaceuticalEngineeringCollege,WestAnhuiUniversity,Liuan237012,China

Objective:In order to establish ELISA method for testing tobacco mosaic virus (TMV) infecting Zingiber officinale Rosc.Methods: Tobacco mosaic virus(TMV) infecting Zingiber officinale Rosc was tested by RT-PCR.Zingiber officinale Rosc leaves which only contained TMV were choiced.TMV particle was purified by centrifugation method.TMV CP was purified through preparation electrophoresis including 12% SDS-PAGE first and then 5%-20% gradient SDS-PAGE.Polyacrylamide gel contained TMV CP was ground into suspension.Mice were immuned with the suspension and antiserum was obtained.Antiserum quality was tested by Western blot and ELISA test.IgG was purified through affinity chromatography method.IgG solution was concentrated and dialyzed to a suitable concentration.The IgG then mixed with glycerol.Results: IgG in antiserum only combined with TMV CP protein and it could combine with nature TMV particle CP protein.Its quality was up to standard.Conclusion: Establishment of ELISA method for testing TMV infecting Zingiber offcinale Rosc is successfull by using this IgG.

Tobacco mosaic virus(TMV);Zingiber offcinale Rosc.;ELISA method

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.016

①本文為安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2013A264,KJ2015A454)和安徽自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MC43)。

韋傳寶(1961年-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物病毒和蛇毒蛋白的研究，同時(shí)就職于皖西學(xué)院抗體制備及其質(zhì)量檢測(cè)中心，E-mail:weichuanbao@sina.com。

Q785S436.421

A

1000-484X(2017)09-1355-05