賈 巖 高宇馳 黎四平 王 鑫 陳 晨 余詩炎 莊澤崗 張俊愛 陳章權(quán) 徐軍發(fā)

(廣東醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所臨床免疫學(xué)研究室，東莞523808)

檢測(cè)人IL-37雙抗夾心ELISA方法的建立①

賈 巖②高宇馳 黎四平③王 鑫 陳 晨 余詩炎 莊澤崗 張俊愛 陳章權(quán) 徐軍發(fā)④

(廣東醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所臨床免疫學(xué)研究室，東莞523808)

目的：建立定量檢測(cè)人血清IL-37的雙抗夾心ELISA。方法：以鼠抗人IL-37單抗作為捕獲抗體，制備的兔抗人IL-37多抗作為檢測(cè)抗體，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG為二抗，重組人IL-37蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，建立檢測(cè)人IL-37的雙抗夾心ELISA方法。并對(duì)該方法的工作條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)其靈敏度、線性范圍、重復(fù)性和對(duì)登革熱非結(jié)構(gòu)蛋白NS1陽性患者血清IL-37的檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：重組IL-37蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品建立的雙抗夾心ELISA法檢測(cè)靈敏度為1.465 μg/L，線性范圍為1.465～46.875 μg/L，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為6.6%和11.7%。采用此方法對(duì)診斷為登革熱的患者血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示非結(jié)構(gòu)蛋白NS1陽性患者IL-37水平顯著高于健康人對(duì)照組。結(jié)論：成功建立了雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，可用于人血清中IL-37的檢測(cè)。

IL-37；雙抗夾心法；ELISA；登革熱

IL-37屬于白細(xì)胞介素-1家族成員，是一種免疫負(fù)向調(diào)控因子，具有抗炎和免疫抑制作用[1-3]。IL-37存在五種不同的剪切異構(gòu)體[1-3]，其中IL-37b是占主導(dǎo)作用的亞型。IL-37前體包含的經(jīng)典caspase-1識(shí)別位點(diǎn)與其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及其胞內(nèi)抗炎作用密切相關(guān)[4-9]。有研究表明IL-37在人體多種正常組織(如淋巴結(jié)、胸腺、骨髓)[10]，人類細(xì)胞系(如THP-1、A431)以及腫瘤組織(如肺癌、宮頸癌)中均有表達(dá)[11，12]?，F(xiàn)已證實(shí)IL-37參與多種炎癥性疾病和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，如腸炎、肝臟缺血再灌注、肥胖、腰間盤退行性變、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎等[14-19]。我們發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清中IL-37水平升高，經(jīng)化學(xué)藥物治療后下降[20]。

鑒于IL-37的生物學(xué)特性，其有可能會(huì)成為一種新型炎癥標(biāo)志物，因此，建立一種靈敏、快速檢測(cè)IL-37的免疫學(xué)方法對(duì)疾病輔助診斷具有重要價(jià)值。本研究在成功制備了抗人IL-37單克隆抗體的基礎(chǔ)上，采用單抗-多抗配對(duì)，建立了檢測(cè)人IL-37的雙抗體夾心ELISA法，為進(jìn)一步研制檢測(cè)人IL-37的ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 雌性新西蘭家兔購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(東莞)；Ni2+-NTA凝膠層析柱購于GE公司；透析袋、96孔Corning可拆卸酶標(biāo)板購于Cornig-Coestr公司；弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)購自Sigma公司；預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker、TMB-H2O2顯色液購于Thermo公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ELISA終止液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購于上海碧云天公司；重組IL-37蛋白(本實(shí)驗(yàn)室自制[21])；鼠抗人IL-37單克隆抗體(本實(shí)驗(yàn)室自制，專利申請(qǐng)?zhí)枺?01610604525.5)；多功能酶標(biāo)儀(基因有限公司syneygy2)；ELISA初篩非機(jī)構(gòu)蛋白NS1陽性的登革熱患者和體檢科檢測(cè)的健康人血清標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)所需緩沖液自行配制。

1.2方法

1.2.1兔抗人IL-37多克隆抗體的制備 按文獻(xiàn)方法[21]，利用IPTG誘導(dǎo)含質(zhì)粒pET28a/IL-37的大腸桿菌菌株表達(dá)重組IL-37蛋白，將誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的表達(dá)情況。然后對(duì)菌體裂解上清液進(jìn)行Ni2+-NTA凝膠層析純化，制備人IL-37蛋白，對(duì)其進(jìn)行濃度測(cè)定，并用PBS將蛋白稀釋至1.0 g/L。第1天取1 ml蛋白與等體積CFA研磨乳化后在兔雙后腿足跖處注射抗原，每側(cè)0.5 ml。第10天同樣取1 ml蛋白與等體積IFA研磨乳化后在兔雙后腿腘窩淋巴結(jié)處注射抗原，每側(cè)0.5 ml。第17、24天免疫時(shí)無需加入佐劑，直接取1 ml 蛋白分別在背部進(jìn)行多點(diǎn)注射和大腿肌肉注射，共免疫家兔4次。末次免疫后1周，頸總動(dòng)脈放血，收集抗血清，以半飽和硫酸銨鹽析法初步純化多抗，分裝-80℃保存。未免疫之前取少量兔血清分裝-80℃保存，作為陰性對(duì)照。

1.2.2兔抗人IL-37多克隆抗體的鑒定 Western blot法檢測(cè)抗血清特異性，質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-37-GFP轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，裂解獲得真核IL-37-GFP融合蛋白，同時(shí)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293-T細(xì)胞煮沸裂解作為陰性對(duì)照，將以上細(xì)胞裂解液進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜。然后加入1∶8 000 稀釋的兔抗血清，4℃孵育過夜。次日加入1∶5 000稀釋的HRP-山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h后暗室曝光。間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)，將純化的重組IL-37蛋白以5 mg/L包被酶標(biāo)板，加入系列倍比稀釋的抗血清，并設(shè)置復(fù)孔，未免疫家兔血清同時(shí)做相應(yīng)比例稀釋作為對(duì)照，37℃ 1 h后加入HRP-山羊抗兔IgG ，加底物顯色，終止反應(yīng)后測(cè)A450值，結(jié)果以A450/陰性孔A450>2.1的稀釋度為最終效價(jià)。

1.2.3雙抗體夾心ELISA方法的建立 采用0.05 mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液為包被液，稀釋鼠抗人IL-37單抗以100 μl/孔包被可拆卸酶標(biāo)板，4℃條件下包被10 h，PBST洗滌5次。50 g/L脫脂奶粉37℃封閉2 h，PBST洗滌5次。在包被好的酶標(biāo)板中分別加入NS1陽性患者血清標(biāo)本100 μl/孔和不同稀釋度的重組IL-37蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，37℃溫育1 h后PBST洗滌5次。加入合適濃度的兔抗人IL-37多抗37℃溫育1 h后PBST洗滌5次，最后加入合適濃度的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃溫育1 h后PBST洗滌5次，加入100 μl/孔的顯色底物TMB，37℃避光顯色15 min，加 50 μl/孔的H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值。

1.2.4ELISA方法的條件優(yōu)化 將兔抗IL-37多抗以1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000四種濃度包被酶標(biāo)板，同時(shí)將HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體以1∶3 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶8 000進(jìn)行稀釋，選取A450值接近1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體為最佳工作濃度。采用棋盤滴定法將鼠抗人IL-37單克隆抗體以1∶100、1∶200、1∶400倍稀釋包被酶標(biāo)板上，加入強(qiáng)陽性抗原和陰性對(duì)照，抗原抗體稀釋液選擇50 g/L的脫脂奶粉，各梯度抗原均設(shè)置復(fù)孔，同時(shí)將兔抗人IL-37多克隆抗體稀釋為1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000。選擇強(qiáng)陽性抗原A450值在1.0左右，陰性對(duì)照A450值小于0.1為捕獲抗體和檢測(cè)抗體的最佳濃度。確定最佳捕獲和檢測(cè)抗體和酶標(biāo)二抗?jié)舛群?，分別用10 ml/L的胎牛血清和50 g/L脫脂奶粉為封閉液，加入等量抗原和陰性對(duì)照，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，其他反應(yīng)條件不變，按夾心ELISA具體步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算P/N(陽性孔與陰性孔吸光度比值)，取P/N值最大為最佳條件。同樣以4℃過夜和37℃ 2 h為封閉時(shí)間，4℃過夜或37℃ 1 h為抗原抗體反應(yīng)時(shí)間，每次實(shí)驗(yàn)僅改變一個(gè)條件，確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.5線性范圍的確定 將純化的IL-37蛋白(0.6 μg/μl)1∶200稀釋后進(jìn)一步倍比稀釋，如1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800直至1∶409 600，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，A450為縱坐標(biāo)，找出線性范圍較好的區(qū)間，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最低檢測(cè)限。

1.2.6重復(fù)性檢測(cè) 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)即使用同一批包被的酶標(biāo)板對(duì)46.875 μg/L的純化抗原重復(fù)檢測(cè)20次，測(cè)其A450，計(jì)算CV值得出批內(nèi)誤差。批間重復(fù)試驗(yàn)分5次檢測(cè)，濃度為46.875 μg/L的純化抗原，每次設(shè)4個(gè)復(fù)孔，測(cè)其A450，計(jì)算CV值得出批間誤差。

1.2.7標(biāo)本檢測(cè) 采用已建立的雙抗體夾心ELISA 方法，對(duì)本室保存的40例NS1陽性患者血清和40例正常人血清進(jìn)行檢測(cè)，每標(biāo)本設(shè)置復(fù)孔。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad 軟件計(jì)算變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)分析登革熱患者和健康人血清中IL-37含量；采用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析法，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兔抗人IL-37多克隆抗體的鑒定 收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-37-GFP 48 h的293-T細(xì)胞，裂解獲得真核IL-37-GFP融合蛋白，分子量為42 kD[22]，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的293-T細(xì)胞作為陰性對(duì)照， Western blot結(jié)果顯示多抗與轉(zhuǎn)染后293-T細(xì)胞表達(dá)的真核蛋白在Mr 42 kD處有條帶產(chǎn)生，而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒則無條帶產(chǎn)生，證明該多抗特異性較好，可以結(jié)合真核IL-37蛋白。將純化的重組IL-37蛋白包被酶標(biāo)板，IL-37多克隆抗體進(jìn)行系列倍比稀釋，間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，其中1號(hào)家兔抗血清效價(jià)為1∶128 000，2號(hào)家兔抗血清效價(jià)為1∶32 000(圖1)。

2.2雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法最佳反應(yīng)條件的確定

圖1 兔抗人IL-37多克隆抗體的鑒定Fig.1 Identification of rabbit anti-human IL-37 polyclonal antibodyNote: 1-3.Eukaryotic protein 20 μl，10 μl，5 μl；4.Empty 293 cell.

2.2.1酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定 兔多抗以不同濃度包被酶標(biāo)板，分別加入1∶3 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，取A450值接近1.0測(cè)定孔的濃度為最佳工作濃度，得出二抗1∶5 000稀釋。

2.2.2單抗和多抗最佳工作濃度的確定 根據(jù)棋盤滴定法檢測(cè)結(jié)果，取強(qiáng)陽性抗原A450值接近1.0，陰性對(duì)照A450值小于0.1測(cè)定孔的濃度為最佳工作濃度，得出單抗1∶200稀釋，多抗1∶6 000稀釋。

2.2.3封閉液、封閉時(shí)間、抗原抗體反應(yīng)時(shí)間的確定 1∶200稀釋的單抗包板后分別用10 ml/L的胎牛血清和50 g/L脫脂奶粉為封閉液，37℃封閉2 h，加入23.44 μg/L的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和50 g/L脫脂奶粉陰性對(duì)照，按夾心ELISA方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，顯色終止反應(yīng)后檢測(cè)各孔OD值，結(jié)果50 g/L脫脂奶粉的P/N值大于10 ml/L 的胎牛血清，采用50 g/L脫脂奶粉為封閉液。同樣方法進(jìn)行ELISA反應(yīng)，每次實(shí)驗(yàn)控制單個(gè)變量，4℃封閉過夜和37℃封閉 2 h的P/N值無明顯差異，為節(jié)約時(shí)間采用37℃ 2 h封閉法?？乖贵w4℃過夜和37℃ 1 h孵育方法相比P/N值也無明顯差異，為節(jié)約時(shí)間采用37℃孵育1 h。

2.2.4線形范圍的確定 原濃度為0.6 μg/μl的抗原倍比稀釋為1∶200～1∶409 600，分別檢測(cè)各孔A450值，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度在1.465～46.875 μg/L時(shí)與A450呈線性相關(guān)，回歸方程為y=0.041x+0.087 7，R2=0.983 5。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.465 μg/L時(shí)，其A450值/陰性孔A450值>2.1，因此，此方法的最低檢出限為1.465 μg/L(見圖2)。

根據(jù)以上結(jié)果，我們確定雙抗夾心ELISA方法的最適工作條件為:1∶200稀釋的鼠抗人IL-37單抗包被， 50 g/L脫脂奶粉作為封閉液， 以1.465～46.875 μg/L重組IL-37蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，1∶6 000稀釋的兔抗IL-37多抗作為檢測(cè)抗體，酶標(biāo)抗體濃度為1∶5 000。

圖2 雙抗體夾心ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of double-antibody sandwichELISA

圖3 正常人及登革熱患者IL-37血清標(biāo)本檢測(cè)Fig.3 ELISA of serum samples from healthy control and Dengue patients

2.3重復(fù)性檢測(cè) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的CV值為6.6%，批間重復(fù)性試驗(yàn)的CV值為11.7%，說明本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好。

2.4初步應(yīng)用 采用本方法對(duì)40例ELISA初篩非機(jī)構(gòu)蛋白NS1陽性的登革熱患者血清和40例正常人血清進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)上述直線回歸方程式代入各樣本OD值，計(jì)算出所有樣本IL-37濃度，采用Graphpad軟件分析，組間比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

3 討論

本研究成功制備了高效價(jià)的兔抗人IL-37多克隆抗體，并采用單抗-多抗配對(duì)建立了檢測(cè)人IL-37的夾心ELISA方法，并對(duì)登革熱患者血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法可以用于人血清IL-37水平的檢測(cè)。

IL-37作為一種抑炎因子和免疫抑制因子在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，有可能會(huì)成為一種炎癥標(biāo)志物，檢測(cè)人血清和血清中IL-37水平已經(jīng)有報(bào)道，目前國際上也有商品ELISA試劑盒供應(yīng)，但該試劑盒價(jià)格昂貴，不利于推廣。本研究在制備了鼠抗人IL-37單抗的基礎(chǔ)上，成功制備了兔抗人IL-37多抗，利用單抗-多抗配對(duì)建立了定量檢測(cè)IL-37的夾心ELISA方法，結(jié)果顯示該方法敏感性較高，最低檢出限為1.465 μg/L，但線性范圍較窄(1.465～46.875 μg/L)?？赡苁潜緦?shí)驗(yàn)采用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)，由于原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)時(shí)在分子修飾方面存在不足，導(dǎo)致與天然存在的蛋白質(zhì)表位之間存在部分差異。因此，由這種與天然蛋白表位存在差異的蛋白免疫動(dòng)物后所得抗體其抗原結(jié)合表位無法與天然蛋白表位完全吻合，導(dǎo)致抗原抗體之間的親和力較弱，結(jié)合率下降。也有可能是蛋白純化不足，雜蛋白較多，而與相應(yīng)單抗結(jié)合的目的蛋白較少，因此相應(yīng)抗原抗體結(jié)合率較低，從而導(dǎo)致最低檢測(cè)限較高，線性范圍較窄。結(jié)果顯示批內(nèi)CV值為6.6%小于10%，批間CV值為11.7%小于20%，均在可允許范圍內(nèi)，說明本方法的精密度較好。對(duì)46.875 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算得出的樣品濃度平均值為48.477 μg/L與真值間的相對(duì)誤差為99.18%在可允許范圍內(nèi)，說明本方法的準(zhǔn)確度較高。同時(shí)在建立該方法的過程中，最初我們采用多抗包被作為捕獲抗體，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，結(jié)果本底偏高，可能是包被的多抗在純化時(shí)存在不足，其他雜蛋白與HRP標(biāo)記羊抗鼠之間有交叉反應(yīng)，選擇抗人IL-37單抗包被后，陰性對(duì)照的A450降至0.05以下，有效地降低了本底，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)選擇脫脂奶粉作為反應(yīng)用稀釋液，這樣可以在每一步反應(yīng)中起到再次封閉作用，降低了非特異性結(jié)合。

登革熱是一種由登革病毒引起的高死亡率急性傳染病。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前有假說認(rèn)為與細(xì)胞免疫系統(tǒng)有關(guān)，在早期登革病毒感染未成熟的朗格漢斯細(xì)胞和角化細(xì)胞，會(huì)引起補(bǔ)體系統(tǒng)和大量非保護(hù)T細(xì)胞的激活以及炎性細(xì)胞因子的過量釋放。而IL-37作為一個(gè)抑炎因子也會(huì)同時(shí)升高從而對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。我們采用現(xiàn)有的商品試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)初篩登革熱非結(jié)構(gòu)蛋白NS1陽性患者血清中 IL-37 水平顯著升高(結(jié)果待發(fā)表)。同樣為了驗(yàn)證本研究建立的ELISA方法的可用性，我們對(duì)初篩NS1陽性登革熱患者和正常對(duì)照組血清中IL- 37水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者血清IL-37水平顯著高于健康對(duì)照，提示我們建立的ELISA方法可用于臨床樣本的檢測(cè)。。

綜上所述，本研究建立了檢測(cè)人IL-37的雙抗體ELISA夾心法，并通過初步應(yīng)用驗(yàn)證了該方法可用于臨床樣本的檢測(cè)，為進(jìn)一步研發(fā)試劑盒奠定了基礎(chǔ)，但該方法線性范圍較窄，檢出下限較高，敏感度稍欠，有待進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)條件。

[1] Banchereau J，Pascual V，O′Garra A.From IL-2 to IL-37:the expanding spectrum of anti-inflammatory cytokines[J].Nat Immunol，2012， 13(10):925-931.

[2] Pan G，Risser P，Mao W，etal.IL-1H，an interleukin 1-related protein that binds IL-18 receptor/IL-1Rrp[J].Cytokine，2001，13(1):1-7.

[3] Taylor SL，Renshaw BR，Garka KE，etal.Genomic organization of the interleukin-1 locus [J].Genomics，2002，79(5):726-733.

[4] Nold MF，Nold-Petry CA，Zepp JA，etal.IL-37 is fundamental inhibitor of innate immunity [J].Nat Immunol，2010，11:1014-1064.

[5] Boraschi D，Lucchesi D，Hainzl S，etal.IL-37:a new anti-inflammatory cytokine of the IL-1 family[J].Eur Cytokine Netw，2011，22:127-147.

[6] Busfield SJ，Comrack CA，Yu G，etal.Identification and gene organization of three novel members of the IL-1 family on human chromosome[J].Genomics，2000，66:213-216.

[7] Kumar S，Hanning CR，Brigham-Burke MR，etal.Interleukin-1F7B (IL-1H4/IL-1F7) is processed by caspase-1 and mature IL-1F7B binds to the IL-18 receptor but does not induce IFN-gamma production[J].Cytokine，2002，18(2):61-71.

[8] Ross R，Grimmel J，Goedicke S，etal.Analysis of nuclear localization of interleukin-1 family cytokines by flow cytometry[J].J Immunol Methods，2013，387(1-2):219-227.

[9] Bulau AM，Nold MF，Li S，etal.Role of caspase-1 in nuclear translocation of IL-37，release of the cytokine,and IL-37 inhibition of innate immune responses[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111(7):2650-2655.

[10] Smith DE，Renshaw BR，Ketchem RR，etal.Four new members expand the interleukin-1 superfamily[J].J Biol Chem，2000，275(2):1169-1175.

[11] Akdis M，Burgler S，Crameri R，etal.Interleukins，from 1 to 37，and interferon-γ:receptors,functions,and roles in diseases[J].J Allergy Clin Immunol，2011，127(3):701-721.

[12] Wang S，An W，Yao Y，etal.Interleukin 37 expression inhibits STAT3 to suppress the proliferation and invasion of human cervical cancer cells[J].J Cancer，2015，6(10):962-969.

[13] Dinarello CA，Bufler P.Interleukin-37[J].Semin Immunol，2013，25(6):466-468.

[14] Imaeda H，Takahashi K，F(xiàn)ujimoto T，etal.Epithelial expression of interleukin-37b in inflammatory bowel disease[J].Clin Exp Immunol，2013，172(3):410-416.

[15] Sakai N，Van Sweringen HL，Belizaire RM，etal.Interleukin-37 reduces liver inflammatory injury via effects on hepatocytes and non-parenchymal cells [J].J Gastroenterol Hepatol，2012，27(10):1609-1616.

[16] Ballak DB，van Diepen JA，Moschen AR，etal.IL-37 protects against obesity-induced inflammation and insulin resistance[J].Nat Commun，2014，5:4711.

[17] Wan ZY，Sun Z，Song F，etal.Downregulated interleukin 37 expression associated with aggravation of intervertebral disc degeneration[J].Int J Clin Exp Pathol，2014，7(2):656-662.

[18] Ye L，Ji L，Wen Z，etal.IL-37 inhibits the production of inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic lupus erythematosus:its correlation with disease activity [J].J Transl Med，2014，12:69.

[19] Chen B，Huang K，Ye L,etal.Interleukin-37 is increased in ankylosing spondylitis patients and associated with disease activity [J].J Transl Med，2015，13:36.

[20] 張俊愛，劉淦斌，曾今誠，等.活動(dòng)性肺結(jié)核患者血漿 IL-37的檢測(cè)及其臨床意義[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31(4):520-523.

[21] 趙付前，何素輝，何玲鴿，等.人IL-37在大腸桿菌表達(dá)及多克隆抗體的制備與鑒定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30(5):0513-0516.

[22] 劉 倩，梁莊嚴(yán)，何素輝，等.IL-37融合EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在293T細(xì)胞中的表達(dá)[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31(9):1399-1403.

[23] Limon-Flores AY，Perez-Tapia M，Estrada-GarciaI，etal.Dengue virus inoculation to human skin explants:an effective approach to assess in situ the early infection and the effects on cutaneous dendritic cells[J].Int J Exp Pathol， 2005，86(5):323-334.

[收稿2017-03-09 修回2017-05-25]

(編輯 倪 鵬)

EstablishmentofadoubleantibodysandwichELISAfordetectionofhumanIL-37

JIAYan，GAOYu-Chi，LISi-Ping，WANGXin，CHENChen，YUShi-Yan，ZHUANGZe-Gang，ZHANGJun-Ai，CHENZhang-Quan，XUJun-Fa.

DepartmentofClinicalImmunology，InstituteofLaboratoryMedicine，GuangdongMedicalUniversity，Dongguan523808，China

Objective:To establish a double antibody sandwich ELISA assay for detection of human IL-37 in serum.Methods: Mouse anti-human IL-37 monoclonal antibody was used as capturing antibody,rabbit anti-human IL-37 polyclonal antibodies served as detection antibody,HRP labeled goat anti-rabbit IgG employed as second antibody and recombinant human IL-37 protein used as reference standard for the establishment of a doubleantibody sandwich ELISA.The working conditions were optimized,such as sensitivity,linear range,reproducibility and evaluated the serum IL-37 in patients with Dengue fever.Results: The sensitivity of the established ELISA method was 1.465 μg/L approximately.Likewise,the linearity range of this method was about (1.465-46.875) μg/L.Further,the co efficient of variation (CV) of inter-batch and intra-batch in this study were 6.6% and 11.7%,respectively.Notably,this method could be used in the detection of IL-37 in serum of the patients with Dengue fever,showing that the level of IL-37 in Dengue fever patients was much higher than that in healthy controls.Conclusion: The double antibody sandwich ELISA assay for the detection of human IL-37 was successfully established,which can be apply to detect of human IL-37 in clinical samples.

IL-37；Double antibody sandwich；ELISA；Dengue

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.014

①本文為國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81570009,81273237)和廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015A030313513)。

賈 巖(1991年-)，女，碩士，檢驗(yàn)技師，主要從事抗體制備及應(yīng)用方面研究，E-mail：616712591@qq.com。

R392.11R392-33

A

1000-484X(2017)09-1346-05

②佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，佛山528200。

③東莞市第八人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，東莞523808。

④通訊作者，E-mail：xujunfa@gdmu.edu.cn。