李君茹 李會方 周 嘉 張麗蕓 盧 曉 左大明 陳政良

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室,廣州510515)

二甲雙胍對U937細胞增殖、周期及凋亡的影響

李君茹 李會方 周 嘉 張麗蕓 盧 曉 左大明 陳政良

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室,廣州510515)

目的：探究二甲雙胍(metformin)對U937細胞增殖、周期及凋亡的影響。方法：以U937細胞為研究對象，予不同濃度的二甲雙胍處理，分別在24、48和72 h收集細胞。CCK-8法檢測細胞增殖情況，流式檢測細胞凋亡及細胞周期，并使用Western blot方法檢測促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2、p-AMPK、p53的表達情況。結(jié)果：CCK8結(jié)果顯示二甲雙胍抑制U937的增殖，且呈時間-劑量依賴性。流式結(jié)果顯示二甲雙胍處理后細胞周期停滯在G0/G1期，G0/G1期細胞比例的增加呈時間-劑量依賴性。二甲雙胍可誘導(dǎo)細胞凋亡，且凋亡率呈劑量依賴性；二甲雙胍濃度為20 mmol/L時，凋亡率呈時間依賴性。Western blot結(jié)果顯示二甲雙胍處理后，p-AMPK、p53、Bax的表達上調(diào)，而Bcl-2的表達下調(diào)。結(jié)論：二甲雙胍能抑制U937細胞的增殖，阻滯細胞周期在G0/G1期，誘導(dǎo)細胞凋亡；其機制可能與其上調(diào)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax的表達、下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達、激活A(yù)MPK/p53通路有關(guān)。

二甲雙胍；U937細胞；增殖；細胞周期；凋亡；AMPK/p53

二甲雙胍是目前用于治療糖尿病的一線口服藥物[1]，其主要藥理作用是通過抑制肝葡萄糖輸出，改善外周組織對胰島素的敏感性、增加對葡萄糖的攝取和利用而降低血糖[2]。近年來，二甲雙胍的抗腫瘤作用受到了極大的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍具有抑制特定腫瘤生長的作用[3,4]。二甲雙胍的抗腫瘤機制成為研究熱點[5-8]。但目前研究多集中于二甲雙胍對實體腫瘤的作用，其對惡性血液系統(tǒng)疾病的研究報道較少。本實驗研究二甲雙胍對人單核細胞白血病細胞系U937細胞的作用，觀察其對U937細胞增殖、周期及凋亡的影響，并探討其可能機制，以期初步了解二甲雙胍在血液病腫瘤中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑 RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；二甲雙胍為美國Sigma公司產(chǎn)品；Cell Counting Kit-8法試劑盒購自上海同仁；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基；BCA蛋白定量試劑盒購于杭州聯(lián)科生物公司；用于免疫印跡的抗Bax抗體購自DB Biotech公司，抗Bcl-2抗體購自ImmunoWay公司，抗p-AMPK、AMPK、p53抗體購自Abcam公司。

1.2實驗方法

1.2.1CCK-8法分析細胞增殖情況 將U937細胞密度調(diào)整為1×105ml-1，接種于96孔培養(yǎng)板，實驗組和對照組每孔加細胞懸液100 μl，空白組加入100 μl完全培養(yǎng)液；實驗組加入二甲雙胍，使其終濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L，每組設(shè)三個復(fù)孔；分別培養(yǎng)48 h、72 h后，再每孔各加入10 μl CCK-8試劑，37℃孵育培養(yǎng)4 h，測A450 nm值。按公式計算細胞的存活率：細胞的存活率=(實驗孔OD-空白孔OD)/(對照孔OD-空白孔OD)×100%。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將U937細胞密度調(diào)整至1×105ml-1，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml；實驗組加入二甲雙胍，使其終濃度至5、10、20 mmol/L，對照組加入與實驗組等體積的完全培養(yǎng)液；分別培養(yǎng)24、48 h后收集細胞，用70%的冷乙醇4℃固定2 h至過夜；按細胞周期檢測試劑盒說明書，加100 RNase 37℃水浴30 min；再加入400 μl PI染色混勻，4℃避光30 min；上機檢測。

1.2.3Annexin V-FITC和碘化丙錠(PI)雙標記法檢測細胞凋亡 將U937細胞密度調(diào)整至1×105ml-1，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml；實驗組加入二甲雙胍，使其終濃度至5、10、20 mmol/L，對照組加入與實驗組等體積的完全培養(yǎng)液；分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集細胞，用冷PBS洗滌2次，后將細胞重懸于100 μl 1×結(jié)合緩沖液中，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后，進行流式細胞儀檢測。在雙變量流式分析的散點圖上，左下象限為正常細胞(Annexin V-/PI-)；右下象限為早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)；右上象限為中晚期凋亡以及壞死的細胞(Annexin V+/PI+)。

1.2.4Western blot檢測Bax、Bcl-2、p-AMPK、p53 (1)將U937細胞密度調(diào)整至1×105ml-1，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml；實驗組加入二甲雙胍，使其終濃度至5、10、20 mmol/L，對照組加入與實驗組等體積的全培；(2)分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集細胞并裂解，提取細胞內(nèi)總蛋白；(3)BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，100℃下變性3 min，加入5×loading buffer；(4)配制12%分離膠和4%積層膠；取30 μg裂解蛋白上樣；(5)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上：200 mA，2 h；(6)含5 BSA的TBST溶液室溫封閉1 h；(7)加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入HPR-抗鼠/抗兔抗體室溫1 h，TBST洗膜5次；(8)ECL曝光。

2 結(jié)果

2.1二甲雙胍對U937細胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，不同濃度二甲雙胍作用U937細胞48、72 h后，各組細胞的生長均受到顯著抑制，且隨著藥物濃度增加和作用時間的延長，抑制作用逐漸增加，呈時間-劑量依賴性，各時間點、各濃度組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為18、7 mmol/L。在進一步實驗中選擇與IC50接近的5、10、20 mmol/L進行細胞周期及細胞凋亡檢測。

2.2二甲雙胍對U937細胞周期的影響 流式結(jié)果顯示，不同濃度二甲雙胍作用U937細胞24、48 h后，各組細胞停滯在G0/G1期的比例增加，且隨著藥物濃度增加和作用時間的延長，G0/G1期所占百分比逐漸增多，呈時間-劑量依賴性，各時間點、各濃度組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3二甲雙胍對U937細胞凋亡的影響 流式結(jié)果顯示，二甲雙胍作用于U937細胞72 h后，5、10、20 mmol/L組的細胞早期凋亡率及中晚期凋亡率均呈增高趨勢，且與對照組相比，5、10、20 mmol/L組的細胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。與對照組相比，20 mmol/L二甲雙胍作用24、48和72 h的細胞凋亡率呈增加趨勢，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖1 二甲雙胍抑制U937的增殖，且呈時間-劑量依賴性Fig.1 Metformin inhibited U937 cells proliferation in a time- and dose-dependent mannerNote: *.Vs control group(metformin 0 mmol/L)，P<0.05；#.vs 48 h group，P<0.05.

2.4二甲雙胍對U937細胞Bax、Bcl-2表達的影響 U937細胞經(jīng)二甲雙胍作用72 h后，收集細胞， 進行Western blot檢測。與對照組相比，促凋亡蛋白Bax的表達隨著二甲雙胍濃度遞增而逐漸增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達逐漸減弱，見圖5A；以20 mmol/L二甲雙胍作用于U937細胞，Western blot結(jié)果顯示，隨著時間的延長，Bax的表達逐漸增強，同時Bcl-2的表達逐漸減弱，見圖5B。

圖2 二甲雙胍使細胞周期停滯在G0/G1期Fig.2 Metformin blocked cell cycle at G0/G1 phaseNote: Vs control group(metformin 0 mmol/L)，*.P<0.05；vs 24 h group，#.P<0.05；vs the previous concentration group at the same time,&.P<0.05.

圖3 二甲雙胍誘導(dǎo)U937的凋亡，呈劑量依賴性Fig.3 Metformin induced cell apoptosis in a dose-depen-dent mannerNote: Vs control group(metformin 0 mmol/L),*.P<0.05；vs the previous time point,#.P<0.05.

2.5二甲雙胍對U937細胞p-AMPK、p53表達的影響 U937細胞經(jīng)二甲雙胍作用72 h后，收集細胞，進行Western blot檢測。與對照組相比，p-AMPK、p53的表達隨著二甲雙胍濃度遞增而逐漸增加，見圖6A；以20 mmol/L二甲雙胍作用于U937細胞，Western blot結(jié)果顯示，隨著時間的延長，p-AMPK、p53的表達逐漸增強，見圖6B。

圖4 二甲雙胍誘導(dǎo)U937的凋亡，呈時間依賴性Fig.4 Metformin induced cell apoptosis in a time-dependent mannerNote: Vs 0 h,*.P<0.05；vs the previous concentration group,#.P<0.05.

圖5 二甲雙胍對凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達的影響Fig.5 Expression of Bax was up-regulated while Bcl-2 expression was down-regulated after metformin treat-ment

圖6 二甲雙胍對p-AMPK、p53表達的影響Fig.6 Expression of p-AMPK,p53 on metformin treatment

3 討論

急性白血病是一種嚴重危害人類健康的惡性血液病，尤其難治性白血病治療頗為棘手，是目前國內(nèi)外血液學(xué)工作者研究的焦點。傳統(tǒng)的細胞毒療法(化療和放療)存在骨髓抑制等嚴重的不良反應(yīng)，且臨床上5年生存率仍然很低，因此，繼續(xù)尋找新的、更為合理的治療途徑是十分必要的。近年來關(guān)于腫瘤與能量代謝關(guān)系的研究越來越多，能量代謝的重編程已成為腫瘤的特征標志之一[9]。AMPK是機體細胞代謝的關(guān)鍵分子，而二甲雙胍是一種重要的AMPK激動劑，主要通過活化AMPK通路來減少肝臟糖異生，同時促進外周組織對葡萄糖的攝取，從而間接達到降低血糖的作用[10]。目前已有實驗研究顯示二甲雙胍對多種實體腫瘤細胞具有抑制增殖的作用，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌等[11-13]。關(guān)于其對惡性血液系統(tǒng)疾病的研究報道較少，因此本實驗旨在觀察二甲雙胍對人白血病細胞U937的作用，初步探討其可能的機制。

本實驗用不同濃度的二甲雙胍處理白血病細胞U937，CCK-8法檢測其增殖情況，結(jié)果顯示二甲雙胍抑制U937細胞的增殖，且這一抑制作用可隨著使用藥物濃度的增加和作用時間的延長逐漸增強，呈時間-劑量依賴性，48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為18、7 mmol/L，提示二甲雙胍對U937細胞的生長有抑制作用。細胞周期的失控是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用常通過對細胞分裂產(chǎn)生周期阻滯而實現(xiàn)[14-16]。因此本實驗中觀察了二甲雙胍處理后細胞的細胞周期的情況，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作用后U937細胞周期停滯在G0/G1期，且呈現(xiàn)一個時間-劑量依賴性，提示二甲雙胍對U937細胞的增殖抑制作用與細胞周期的阻滯相關(guān)。目前關(guān)于二甲雙胍對多種實體腫瘤細胞具有抑制增殖的作用均與細胞凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)[11-13]，而細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)是激發(fā)了蛋白酶組成的級聯(lián)反應(yīng)并受細胞內(nèi)部多種基因的直接調(diào)控，其中，最重要的調(diào)控基因為Bcl-2基因家族。Bcl-2基因家族可分為抑制凋亡的Bcl-2亞族(Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1、CED9等)和促進凋亡的Bax亞族(Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等)，它們表達的蛋白質(zhì)分別稱為Bcl-2蛋白和Bax蛋白。Bcl-2蛋白阻抑細胞凋亡，Bax蛋白則促進細胞凋亡，兩者表達失衡可能改變細胞凋亡的進程。在本次研究中，流式細胞儀的結(jié)果顯示二甲雙胍能提高U937細胞的凋亡率，并呈時間-劑量依賴性，Western blot檢測的結(jié)果也顯示其上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達同時下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，表明二甲雙胍通過影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達調(diào)控來誘導(dǎo)U937細胞的凋亡。

二甲雙胍在體內(nèi)主要通過激活A(yù)MPK通路來影響糖代謝，提示其對腫瘤細胞抵制作用也可能與AMPK通路有關(guān)[12,17]。目前有研究表明AMPK確實可以通過負調(diào)控mTOR信號抑制腫瘤細胞的生長[18]，也有研究提出AMPK可以通過上調(diào)p53蛋白的表達水平來發(fā)揮抗腫瘤作用的觀點[19,20]。通過活化AMPK通路發(fā)揮抗腫瘤的作用可存在多種機制的共同作用、相互影響，其中具體的復(fù)雜機制尚未完全的闡明。本次研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作用于U937細胞后，AMPK的磷酸化蛋白表達水平、p53的表達水平均上調(diào)。已知在肝癌細胞系HepG2中AMPK通路的活化可以上調(diào)p53蛋白的表達，而二甲雙胍可以通過影響AMPK/p53通路來促進細胞的凋亡并抑制細胞的增殖[19,20]。我們的研究結(jié)果則提示U937細胞中二甲雙胍也可能通過影響AMPK/p53通路來抗腫瘤，但是AMPK是否直接影響p53信號及p53信號接下去是如何發(fā)揮抗腫瘤作用的機制相當復(fù)雜，是否與其他的通路和機制間相互作用，尚需進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)二甲對白血病細胞U937細胞生長也具有抑制作用，其機制與誘導(dǎo)細胞G0/G1期阻滯、調(diào)控細胞凋亡、激活A(yù)MPK/p53通路有關(guān)。本研究結(jié)果提示二甲雙胍可考慮用于實體瘤的治療外，也有可能作為一種用于血液系統(tǒng)腫瘤治療的侯選藥物。然而，需要指出的是，目前關(guān)于二甲雙胍和腫瘤的相關(guān)研究所用的劑量均是高于其作為降糖藥(血藥濃度：約0.465～2.5 mg/L)的劑量，而結(jié)合我們的結(jié)果來看，可以考慮在進一步的研究中降低藥物劑量，延長作用時間，最好作為輔助藥物搭配其他的抗瘤藥物使用。因此，二甲雙胍對其他不同的白血病細胞系或原代細胞的作用及機制是什么，和其他抗瘤藥物搭配使用的效果如何，仍需要進一步的體外和體內(nèi)實驗來進行探討。

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[收稿2016-12-05 修回2017-01-20]

(編輯 許四平 劉格格)

Effectofmetforminonproliferation,cellcycleandapoptosisofU937cells

LIJun-Ru,LIHui-Fang,ZHOUJia,ZHANGLi-Yun,LUXiao,ZUODa-Ming,CHENZheng-Liang.

DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Objective:To study the effect of metformin on proliferation,cell cycle and apoptosis of U937 cells.Methods: U937 cells were treated with different concentrations of metformin，collected cells in 24,48 and 72 hours.Subsequently,cell proliferation was assessed by CCK-8 assay,and the cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry (FCM).The expression of Bcl-2,Bax,p-AMPK,p53 were determined by Western blot.Results: The proliferation of U937 cells was inhibited by metformin in a time-and dose-dependent manner.Metformin-treated cells were arrested at G0/G1 phase,the cell frequency at G0/G1 phase was increased in a time-and dose-dependent manner.Metformin also induced cell apoptosis in a dose-dependent manner.It showed that 20 mmol/L metformin induced cell apoptosis in a time-dependent manner.The expression of p-AMPK,p53,Bax was up-regulated while Bcl-2 expression was down-regulated after metformin treatment.Conclusion: Metformin could inhibit the U937 cell proliferation,block the cell cycle at G0/G1 phase,and induce cell apoptosis,which may partially be attribute to the up-regulation of Bax,down-regulation of Bcl-2,activation of AMPK/p53 signaling.

Metformin;U937;Proliferation;Cell cycle;Apoptosis;AMPK/p53

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.008

李君茹(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事天然免疫方面的研究，E-mail:656069451@qq.com。

及指導(dǎo)教師：陳政良(1957年-)，男，博士，教授，主要從事天然免疫方面的研究，E-mail:zhlchen@smu.edu.cn。

R73.36

A

1000-484X(2017)09-1315-05