阿依江·卡那提拜克，姚 剛，王世民

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

疾病防控

新疆某羊場巴氏桿菌的分離、鑒定與藥敏試驗

阿依江·卡那提拜克，姚 剛，王世民

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

為確診新疆某羊場疑似感染巴氏桿菌羔羊的發(fā)病病源，并為其提供用藥方案，對該病病原菌進行分離鑒定、動物實驗、組織病理形態(tài)變化及藥敏試驗。結(jié)果表明：分離出的1株優(yōu)勢菌對小鼠具有較強的致死性，瑞士染色及生理生化鑒定致病菌為巴氏桿菌，攻毒小鼠在其組織病理形態(tài)上有不同程度的病理變化，其中肺和肝的病理變化較為顯著，該致病菌對青霉素、妥布霉素、頭孢噻吩鈉、多粘菌素藥物敏感。

巴氏桿菌；分離；鑒定；組織病理形態(tài)；藥敏試驗

巴氏桿菌是動物體內(nèi)常見的條件致病性細菌之一，當外界因素劇烈變化或機體抵抗力下降時，常可使動物致病，嚴重可致動物死亡［1］。巴氏桿菌病是以高熱、肺炎、急性胃腸炎及內(nèi)臟廣泛性出血為主要特征的一種急性、熱性傳染病。病原體多次通過易感動物，毒力逐漸增強，隨病獸分泌物和排泄物排出的病原體經(jīng)消化道和呼吸道再感染新的個體，造成大批動物發(fā)病。我國的馬文戈等［2］首次從病牛組織中分離得到莢膜A型Pm巴氏桿菌。大量研究表明，巴氏桿菌是引起牛、豬等多種畜禽發(fā)生傳染病的病原菌，主要引起動物發(fā)生出血性敗血病或傳染性肺炎［3-5］。巴氏桿菌為條件性致病菌，在正常情況下，羊場養(yǎng)殖環(huán)境中就可能存在該病原菌，但只有在動物機體免疫屏障受損的情況下，才能乘虛而入，侵入羊只體內(nèi)，大量繁殖而導(dǎo)致發(fā)?。?］。因此，羊場應(yīng)制定科學(xué)的保健防病方案，比如采用中草藥拌料或飲水飼喂，加強飼養(yǎng)管理，均衡飼料全價營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，完善程序免疫，提高羊只的機體免疫力，即可有效防止內(nèi)源性或外源性感染而誘發(fā)本?。?］。

本試驗采集疫區(qū)羊群中染病羔羊的不同臟器組織，對疑似巴氏桿菌病進行了病原微生物的分離鑒定，并觀察小鼠攻毒死亡后組織病理形態(tài)變化，還對抗菌藥物的敏感性進行了研究，為當?shù)赜行Х乐瓢褪蠗U菌病提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源 病料采集來源于新疆某羊場病死羊的心臟、肝臟、脾臟和肺臟等組織樣本。

1.1.2 培養(yǎng)基 10%綿羊血瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器及試劑 常用新藥敏紙片（產(chǎn)品編號C047），購于杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌生化鑒定管，購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；移液槍、接種環(huán)、PBS磷酸鹽緩沖液、瑞士染色液、多功能振蕩器（ST-98AB），購自北京桑翌實驗儀器研究所；4℃冰箱（BCD-196F），購自青島海爾股份有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9140A），購自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-30KB），購自上海申安醫(yī)療器械廠；凈化工作臺（SWCJ-2FD），購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S），購自江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；生物組織包埋機（BMJ-1），購自天津天利航空機電有限公司；電鏡切片機（LKB－8800），購自瑞典LKB-BROMMA公司。

1.1.4 試驗動物 健康級18 g左右KM小鼠，購自新疆醫(yī)科大學(xué)試驗中心。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀 觀察記錄。

1.2.2 細菌染色及形態(tài)觀察 將無菌采集的病料預(yù)先劃線接種于10%綿羊血瓊脂平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待長出特征性菌落，置4℃冰箱保存，備用。

1.2.3 致病菌分離培養(yǎng)與純化 用新鮮病料切面在載玻片上壓印制成抹片，甲醇固定2～3 min后使其自然干燥，分別進行革蘭氏染色和瑞氏染色，顯微鏡下觀察細菌染色特性及形態(tài)特征。

1.2.4 生化鑒定 將分離的細菌按常規(guī)［8］方法置于無菌操作臺上，于距離內(nèi)容物上方2 cm處用砂條割開微型生化鑒定管，迅速用酒精燈火焰消毒，然后用接種環(huán)分別挑取分離培養(yǎng)所得的單菌落，進行吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、海藻糖等生化發(fā)酵試驗。對其進行生化鑒定并記錄結(jié)果。

1.2.5 動物試驗 取健康小鼠20只，分為2組，試驗第1組接種細菌血清肉湯培養(yǎng)物，每只小鼠腹腔注射0.2 mL（100 cfu/mL）；試驗第2組接種同批制作的血清肉湯作為對照，觀察小白鼠發(fā)病情況。對死亡小鼠剖解，并從心血、肝、腎進行抹片及瑞士染色，顯微鏡形態(tài)觀察，并根據(jù)王金爾等［9］方法對第1組解剖小鼠實質(zhì)器官做石蠟切片，進行組織病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.6 藥敏試驗 參照文獻［10］介紹的方法進行。用1 mL滅菌吸管吸取0.3 mL肉湯培養(yǎng)物加入90 mm平板培養(yǎng)基內(nèi)，用涂菌棒均勻涂開，放置5 min，待培養(yǎng)基表面稍干后，沿平皿邊緣（距皿內(nèi)壁約1 cm）均勻貼上藥敏紙片，每個平皿內(nèi)貼上6個，37℃溫箱培養(yǎng)24 h后測量每個藥敏紙片的抑菌直徑d（單位：mm）并記錄。

結(jié)果判定方法為：青霉素類抑菌直徑d≥28 mm為高敏感；20 mm≤d＜28 mm為中度敏感；d＜20 mm為低度敏感，d=0為不敏感。藥物對其他菌株的判定標準為：d＞16 mm為高敏感，10 mm≤d＜16 mm為中度敏感，d＜10 mm為低度敏感，d=0為不敏感。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及病理變化

羊發(fā)病后，精神沉郁，食欲廢絕，咳嗽，體溫升高至41～42℃。后期出現(xiàn)腹瀉，并且混有血液。

臟器呈土黃色，腸管血便，無其他明顯病理變化。

2.2 細菌培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察結(jié)果

病料接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h后，營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上細菌生長不良；接種10%血瓊脂平板培養(yǎng)基上，細菌生長良好，形成灰白色、圓形、微隆起、半透明、濕潤、表面光滑、邊緣整齊的露珠樣菌落。接種血清肉湯培養(yǎng)基細菌生長良好，肉湯渾濁。取血瓊脂平板培養(yǎng)基上的優(yōu)勢菌進行革蘭氏染色鏡檢，呈革蘭氏陰性小桿菌，兩端鈍圓，以單個或成雙排列為主。

2.3 細菌染色及形態(tài)觀察結(jié)果

分離純化的細菌，革蘭氏染色鏡檢，觀察到革蘭氏陰性小桿菌。瑞氏染色鏡檢，觀察到兩極著色的小桿菌。見圖1和圖2。

圖1 革蘭氏陰性小桿菌（100×）

圖2 瑞士染色（100×）

2.4 生化試驗結(jié)果

將細菌培養(yǎng)物接種于生化培養(yǎng)基，結(jié)果見表1。分離菌株與參考菌株進行比對，判定為巴氏桿菌。

2.5 動物接種試驗結(jié)果

將細菌分離物接種至小鼠，第1組3只小鼠均在接種后6～8 h出現(xiàn)精神沉郁，被毛蓬亂，48 h內(nèi)死亡，剖檢無明顯的病理變化。取出第1組小鼠腎臟、肝臟，直接涂片進行瑞士染色，鏡檢觀察到兩極著色的小桿菌。見圖3。

表1 分離菌株的生化試驗

圖3 第1組小鼠腎臟瑞士染色

2.6 病理切片

做石蠟切片后在光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察。肺：肺臟局部氣腫，肺泡壁擴張、破裂并伴隨炎性細胞浸潤；肝：肝臟出現(xiàn)明顯的局灶性壞死，肝細胞變性壞死并發(fā)生核濃縮，有成纖維細胞和巨噬細胞浸潤的現(xiàn)象；脾：脾臟發(fā)生淋巴細胞增生，淋巴濾泡，點狀壞死；腎：腎小管上皮細胞排列整齊，動脈血管壁結(jié)締組織增厚，腎小球有萎縮變小，變性壞死及炎癥現(xiàn)象，腎間質(zhì)主要為淋巴細胞和淋巴樣細胞浸潤；心：心臟發(fā)生水腫，心肌纖維間質(zhì)增寬，但排列較整齊，心臟發(fā)生顆粒變性（心肌纖維里面出現(xiàn)了很多紅色的小顆粒）。見圖4～8。

圖4 小鼠肺臟

圖5 小鼠肝臟

圖6 小鼠脾臟

圖7 小鼠腎臟

圖8 小鼠心臟

2.7 藥敏試驗結(jié)果

試驗共應(yīng)用31種藥物的藥敏紙片，對分離細菌進行了耐藥性測試，依照判定標準，所分離的巴氏桿菌耐藥性相同，對青霉素、妥布霉素、頭孢噻吩鈉、多粘菌素的敏感性最強；對復(fù)方新諾明、頭孢西叮、氨曲南、呋喃妥因、氨芐西林、粘菌素B、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感性居中；對頭孢他啶、克林霉素、諾氟沙星、阿米卡星、鏈霉素、頭孢吡肟、克拉霉素、卡那霉素不敏感。見表2。

表2 巴氏桿菌對抗生素敏感性分析 mm

3 討論

有研究表明［11-16］，動物可能因季節(jié)寒冷、環(huán)境潮濕、抵抗力下降以及營養(yǎng)不良導(dǎo)致發(fā)生巴氏桿菌病。本研究中雖然該羊場羔羊全部舍飼喂養(yǎng)，但因圈舍排糞板損壞，致使羔羊尿液排不出去，舍內(nèi)濕度太大，再加上新疆冬天氣溫低，為保溫加劇了圈舍的通風不良、空氣污濁、氨氣濃度過高，導(dǎo)致羔羊所處環(huán)境不良及抵抗力下降是發(fā)生這次巴氏桿菌病的主要因素。此外，該羊場在羔羊出現(xiàn)發(fā)病癥狀后沒有采取及時有效的綜合性防治措施，既沒有改善羔羊的飼養(yǎng)環(huán)境條件，也沒有及時通過選擇敏感藥物對病羊及時治療。

小鼠臟器組織的病理變化發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟水腫，肺泡壁擴張破裂，肝臟上出現(xiàn)局灶性壞死，腹腔內(nèi)有黃色粘性液體滲出物，這些病變與巴氏桿菌在羊臟器組織上引起的病變有相同之處。

青、鏈霉素等抗生素曾在多年的獸醫(yī)臨床應(yīng)用中被認為是巴氏桿菌的敏感藥物和首選藥物［17］。本試驗結(jié)果表明，巴氏桿菌對青霉素敏感，但是對鏈霉素耐藥性極高，這與該羊場藥物使用單一，并且不進行及時治療和用藥，沒有使病情得到控制有關(guān)。

4 結(jié)論

導(dǎo)致該羊場羔羊致病的致病菌為巴氏桿菌，其對青霉素、妥布霉素、頭孢噻吩鈉、多粘菌素的敏感性最強；對復(fù)方新諾明、頭孢西叮、氨曲南、呋喃妥因、氨芐西林、粘菌素B、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感性居中；對頭孢他啶、克林霉素、諾氟沙星、阿米卡星、鏈霉素、頭孢吡肟、克拉霉素、卡那霉素不敏感。

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Isolation，Identification and Sensitivity Testofthe Pathogens in a Xinjiang Sheep Farm

Ayijiang·kanatibaike，Yao Gang，Wang Shimin
（College ofVeterinary Medicine，Xinjiang AgriculturalUniversity，Urumqi830052，China）

In orderto diagnose the pathogenesis oflambs in a sheep farm in Xinjiang，and to provide a drug regimen，the pathogen isolation and identification，animal experiments，histopathological changes and drug susceptibility test were done.The results showed that one of the dominant bacteria had a strong lethal effect on mice，and the pathogenicity was similar to that of Pasteurella，and the pathologicalchanges ofthe mice were observed in differentways.The pathologicalchanges were more obvious in the lung and liver，the pathogen was sensitive to penicillin，tobramycin，cephalosporin sodium，polymyxin drugs.

Pasteurella；isolation；identification；histopathologicalmorphology；sensitivity test

S826.7

A

2095-3887（2017）05-0041-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.05.010

2017-05-23

阿依江·卡那提拜克（1991-），女，碩士研究生。

姚剛（1959-），男，教授。