郭 憲，包鵬甲，胡顯忠，丁學(xué)智，吳曉云，閻 萍，裴 杰

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅省科學(xué)院，蘭州 730000）

遺傳育種與繁殖

西藏亞東牦牛線粒體DNA分析及系統(tǒng)進化研究

郭 憲1，包鵬甲1，胡顯忠2，丁學(xué)智1，吳曉云1，閻 萍1，裴 杰1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅省科學(xué)院，蘭州 730000）

應(yīng)用基因測序技術(shù)對西藏亞東牦牛線粒體基因組進行測序，并對測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與修剪及基因組組裝、精細注釋、功能注釋與分析。結(jié)果表明：亞東牦牛線粒體基因組大小約為15 389 bp，包含13個PCGs、21個tRNAs、2個rRNAs及1個D-loop，其A+T堿基含量為60.86%，G+C堿基含量為39.14%；編碼基因（PCGs、tRNAs&rRNAs）片段總長度為14 495 bp，占基因組總長度的94.19%；同時，分析了亞東牦牛與其他11個物種間的進化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)亞東牦牛與甘南牦牛歸為一類，親緣關(guān)系最近。西藏亞東牦牛線粒體DNA分析為研究牦牛群體遺傳、起源與分子進化提供了技術(shù)參考。

牦牛；線粒體DNA；系統(tǒng)進化

牦牛是分布于青藏高原及其毗鄰地區(qū)的特有牛種資源，可提供肉、乳、毛絨等，是高寒牧區(qū)的基本生產(chǎn)生活資料。牦牛對高寒、缺氧等生態(tài)環(huán)境具有極強的適應(yīng)能力，在低氧適應(yīng)遺傳上是一個極為寶貴的基因庫，研究牦?；蚪M和親緣關(guān)系對牦牛遺傳資源的保護與合理開發(fā)利用具有重要的意義。線粒體DNA是分子生物學(xué)研究中的重要分子標(biāo)志之一。亞東牦牛線粒體基因組測序分析及系統(tǒng)進化研究有助于更好地了解牦牛特別是西藏牦牛群體遺傳進展與進化歷史。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

從西藏自治區(qū)日喀則地區(qū)亞東縣放牧牦牛群中，隨機選擇成年健康的母牦牛6頭，采集血液樣品，冷凍保存帶回實驗室。采用動物血液基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）提取樣品基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴增和目的基因測序

根據(jù)GenBank公布的普通牛線粒體DNA全序列（登錄號NC_006853）設(shè)計6對引物，引物序列及擴增片段大小見表1［生工生物工程（上海）股份有限公司合成］。PCR擴增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，然后94℃變性30 s、55℃退火40 s、72℃延伸4 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)總體積為50μL，其中LA Taq預(yù)混合酶25μL，DNA模板2μL（100 ng/μL），上下游引物各1μL（10 pmol/μL），滅菌ddH2O 21μL。PCR擴增后，其產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒回收、純化PCR產(chǎn)物后，送往百邁客生物科技有限公司，按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol執(zhí)行，利用樣品的基因組 DNA構(gòu)建 500 bp文庫，在 Hiseq 2500測序平臺雙向測序。

表1 牦牛mtDNA擴增引物

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對測序產(chǎn)生的原始reads進行評估，再通過過濾低質(zhì)量、糾錯等方法得到高質(zhì)量的reads，scaffold補gap引物序列見表2，反應(yīng)條件和程序同1.2。然后使用Velvet軟件［1］進行基因組的組裝，使用Repeat Masker軟件［2］對細菌基因組進行重復(fù)序列的屏蔽，使用軟件DOGMA（http：//dogma.ccbb.utexas.edu/）對組裝后的基因組進行基因預(yù)測，使用GENEIOUS R8（Biomatters Ltd.，Auckland，New Zealand）軟件對線粒體基因組進行注釋，并通過MEGA軟件［3］構(gòu)建進化樹，研究物種間的進化關(guān)系。

表2 scaffold補gap引物序列

1.4 基因功能注釋

利用預(yù)測得到的基因序列與COG［4］、KEGG［5］、GO［6］等功能數(shù)據(jù)庫做BLAST比對，進行基因的COG功能富集分析、GO功能富集分析等基因功能注釋分析。

2 結(jié)果

2.1 基因組組裝結(jié)果

利用得到的高質(zhì)量Pair-end數(shù)據(jù)基于Kmer分布圖進行基因組大小的評估，17-mer總數(shù)為5 272 946 280，平均kmer深度為329 100，估計基因組大小約16 022 bp。使用Velvet軟件對高質(zhì)量數(shù)據(jù)進行組裝，共得到5條1 kb以上的基因組序列，將5條contig根據(jù)與近緣物種比對后的位置信息，拼裝成一條基因組序列，總長15 389 bp，具體見表3。A+T堿基含量為60.86%，G+C堿基含量為39.14%。編碼基因（PCGs、tRNAs& rRNAs）片段總長度為15 389 bp，占基因組總長度的94.19%。

表3 牦牛線粒體基因組注釋

2.2 基因組注釋

使用RepeatMasker軟件對細菌基因組進行重復(fù)序列屏蔽，預(yù)測到亞東牦牛簡單重復(fù)序列占30.1%，小重復(fù)序列占69.9%。通過DOGMA軟件分析，亞東牦牛含13個編碼基因序列，23個非編碼基因序列（2個rRNA和21個tRNA），具體基因組注釋結(jié)果見圖1。

2.3 基因功能注釋

利用預(yù)測得到的基因序列與COG、GO等功能數(shù)據(jù)庫做BLAST比對，進行基因的COG功能富集分析、GO功能富集分析等基因功能注釋分析，結(jié)果分別見圖2、圖3。

圖1 亞東牦牛線粒體基因組注釋結(jié)果示意圖

圖2 COG分類統(tǒng)計結(jié)果

圖3 GO注釋聚類統(tǒng)計結(jié)果

2.4 物種間進化關(guān)系分析

使用亞東牦牛線粒體和其他11個物種線粒體的核酸序列，通過MEGA軟件構(gòu)建進化樹，研究物種間的進化關(guān)系，12個線粒體之間的進化關(guān)系見圖4。結(jié)果顯示，亞東牦牛（156）與甘南牦牛（登錄號KJ704989）歸為一類，親緣關(guān)系最近。與大通牦牛（GenBank登錄號KJ463418）、無角牦牛（GenBank登錄號KM658599）親緣關(guān)系較近，與野牦牛（GenBank登錄號KM233417）次之，與其他牛屬物種間均較遠。

圖4 基于亞東牦牛線粒體序列（156）的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 分析與討論

線粒體是一種存在于所有真核動物細胞中的半自主性細胞器，由內(nèi)膜、外模、基質(zhì)和突出的嵴構(gòu)成。在線粒體內(nèi)部存在著線粒體自身的遺傳物質(zhì)——線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）和一些與有氧呼吸有關(guān)的酶［7］。動物線粒體DNA的特點是：①分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、編碼效率高。線粒體DNA一般為長度約5μm的共價雙鏈環(huán)狀分子，結(jié)構(gòu)緊湊。②母系遺傳，基因間重組小。線粒體DNA遵循母性遺傳，即子代的線粒體DNA完全是來自于母本。③變異率高，進化速度快。線粒體DNA是直接裸露的環(huán)狀DNA分子。D-Loop區(qū)位于tRNApro和tRNAphe之間，因不編碼基因，其產(chǎn)生的突變可以不斷地得到積累而對線粒體的功能不產(chǎn)生影響，因此具有更大的進化速率。④遺傳密碼特殊。⑤無組織特異性。本研究中，測得西藏亞東牦牛線粒體長度為15 389 bp，包含13個PCGs、21個tRNAs、2個rRNAs及1個D-loop，其A+T堿基含量為60.86%，G+C堿基含量為39.14%。編碼基因（PCGs、tRNAs&rRNAs）片段總長度為14 495 bp，占基因組總長度的94.19%。本研究獲得的結(jié)果，與其他大多數(shù)哺乳動物的線粒體DNA結(jié)構(gòu)基本一致，為研究西藏亞東牦牛的群體遺傳和進化歷史提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

線粒體DNA在牛上的研究與應(yīng)用非常廣泛，主要是通過對線粒體DNA遺傳變異產(chǎn)生的多態(tài)性的研究，以了解牛品種的進化歷史、分類地位和相互關(guān)系，并應(yīng)用于品種種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)進化、物種起源與分化等方面，為資源保護和品種改良及利用提供技術(shù)參考。本研究通過對亞東牦牛線粒體DNA的COG、GO分析，證實了線粒體在體內(nèi)處于新陳代謝和能量轉(zhuǎn)換的中心地位，可產(chǎn)生體內(nèi)約90%的ATP。GO總共有3個本體（ontology），分別描述基因的分子功能（molecular function）、所處的細胞位置（cellular component）、參與的生物過程（biologicalprocess）。本研究同時分析了亞東牦牛與其他11個物種之間的進化樹關(guān)系，結(jié)果表明亞東牦牛與甘南牦牛歸為一類，說明其親緣關(guān)系最近；與大通牦、無角牦牛親緣關(guān)系較近，與野牦牛次之，與其他牛屬物種間均較遠。

線粒體DNA是一種核外遺傳物質(zhì)，與核DNA相比，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、母性遺傳、無組織特異性及提取方便等特點，使得其成為研究動物起源進化及群體遺傳分化的理想對象。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對線粒體和線粒體DNA的研究將更加深入，從而使研究牦牛的起源進化、系統(tǒng)發(fā)育和種質(zhì)資源保護更有利于人類需要的方向發(fā)展。

［1］ Zerbino D R，Birney E.Velvet：algorithms for the de novo short read assembly using de Bruijn graphs［J］.Genome Research，2008，18：821-829.

［2］ Chen N.Using repeat masker to identify repetitive elements in genomic sequences［M］.Curr Protoc Bioinformatics，USA：John Wiley＆Songs，Inc.2004.

［3］ Koichiro Tamura，Joel Dudley，Masatoshi Nei，et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24：1596-1599.

［4］ Tatusov R L，Galperin MY，Natale D A，et al.The COG database：a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution［J］. Nucleic Acids Research，2000，28（1）：33-36.

［5］ Kanehisa M，Goto S，Kawashima S，etal.The KEGG resource for deciphering the genome［J］.Nucleic Acids Research，2004，32（Sl）：277-280.

［6］ Ashburner M，Ball C A，Blake J A，et al.Gene Ontology：tool for the unification ofbiology［J］.Nature Genetics，2000，25（1）：25-29.

［7］ 孟彥，許尚忠，昝林森.線粒體DNA在牛遺傳育種的應(yīng)用[J].家畜生態(tài)學(xué)報，2006，27（1）：92-95.

Analysis on Phyletic Evolution and MitochondrialDNA of Yadong Yak（Bosgrunniens）in Tibet

Guo Xian，Yan Ping，PeiJie，etal
（Lanzhou Institute ofHusbandry and PharmaceuticalSciences，Chinese Academy ofAgriculturalSciences，Lanzhou 730050，China）

The complete mitochondrialgenome sequence of Yadong yak（Bos grunniens）in Tibethas been sequenced by gene sequencing technique，the sequencing data were analyzed by quality control and pruning，genome assembly，fine annotation，functionalannotation and analysis.The resultsshowed thatthe complete mitochondrialgenome ofYadongyak in Tibetwas15 389 bp，which contained 13 protein-coding genes，21 tRNA genes，2 rRNA genes and a non-coding controlregion（D-loop region）.The overallbase paircomposition were 60.86%A+T and 39.14%G+C，the totallength ofcoding genes（PCGs，tRNAs&rRNAs）were 14 495 bp，accounting for 94.19%ofthe totallength ofgenome.Atthe same time，the mtDNA of Yadong yak were analyzed with otherevolutionary relationships between 11 species，the resultshowed that Yadong yak and Gannan yak were classified as a class. The mitogenome sequence of Yadong yak would contribute to better population genetics protection and evolution understanding of Bos grunniens.

yak；mitochondrialDNA；phyletic evolution

S823.2

A

2095-3887（2017）05-0001-06

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.05.001

2017-07-17

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-37）；甘肅省科技支撐計劃項目（1504NKCA052）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01）

郭憲（1978-），男，副研究員，博士。研究方向：動物遺傳資源與繁育。

閻萍，研究員，博士；裴杰，副研究員，博士。