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上皮性卵巢癌病人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與栓塞的相關(guān)性研究

張玲，喬翠峰，杜秀萍

目的利用免疫磁珠法富集上皮性卵巢癌合并靜脈血栓(VET)病人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)，觀察血液CTCs水平與病人靜脈血栓的相關(guān)性。方法采集2016年1月—2017年1月確診的62例卵巢癌合并VET病人外周血，應(yīng)用免疫磁珠法富集上皮性卵巢癌病人的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，研究CTCs水平與病人栓塞的關(guān)系。結(jié)果62例上皮性卵巢癌合并VET病人47例為CTCs陽性，CTCs陽性率與上皮性卵巢癌病人的年齡、腫瘤部位、TNM分期及纖維蛋白原無關(guān)(P>0.05)；與CA125、血小板數(shù)量及抗凝血酶Ⅲ密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CTCs監(jiān)測可能為預(yù)測卵巢癌病人靜脈栓塞的有效方法。

上皮性卵巢癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；栓塞

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其主要死因是腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤相關(guān)性栓塞癥[1-2]。卵巢癌病人發(fā)生靜脈血栓栓塞(VTE)包括深靜脈血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的風(fēng)險(xiǎn)較非腫瘤病人高數(shù)倍。有文獻(xiàn)表明：外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞高的腫瘤病人血栓風(fēng)險(xiǎn)升高[3-4]。

近年來，新興循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)，可幫助腫瘤病人了解外周血腫瘤細(xì)胞情況，盡早預(yù)測腫瘤病人發(fā)生血栓的可能性。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是指自發(fā)或診療操作手段由腫瘤原病灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[5 ]。檢測腫瘤細(xì)胞相當(dāng)于“體液活檢”，為病人提供重要的病情信息。但CTCs在血液中受到大量正常血細(xì)胞干擾，因此需要敏感的CTCs收集鑒定檢測手段[6]。上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecular，EpCAM)是一種由GA-733-2基因編碼的分子量為40 kDa的跨膜糖蛋白，作為嗜同種的鈣非依賴性上皮細(xì)胞間黏附分子在上皮癌變過程中發(fā)揮作用。本研究采用EpCAM結(jié)合超順磁性免疫磁珠在磁場磁力作用下與其他物質(zhì)分離，從而收集腫瘤細(xì)胞[7]，通過EpCAM免疫磁珠富集法收集上皮性卵巢癌合并VET病人外周血中CTCs，以期了解CTCs水平與卵巢癌病人VET的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集山西省腫瘤醫(yī)院婦產(chǎn)科2016年1月—2017年1月上皮性卵巢癌病人62例，年齡20歲～60歲，平均42.7歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷為上皮性卵巢癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)合并其他原發(fā)惡性腫瘤；未接受手術(shù)治療或手術(shù)后未未化療；未完成整個(gè)化療期周期的。對(duì)照組為同期就診的20例卵巢癌病人，年齡20歲～60歲，平均年齡44.5歲。

1.2 主要試劑 抗EpCAM免疫磁球購于上海美吉生物有限公司，CD45-PE和CK19/FITC標(biāo)記抗體購于上海瑞齊生物科技有限公司，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diami-no-2-phenylindole，DAPI)購自美國Sigma公司?？偰懝檀?、羧甲基殼聚糖十六烷基季銨鹽(HQCMC)、1，2-二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)、二氯甲烷、二價(jià)鐵鹽(FeSO4·7H2O)、三價(jià)鐵鹽(FeCl3·6H2O)、NH3·H2O、N-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)等常用試劑均購自上海美吉生物有限公司。人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購于上海江林生物科技公司。

1.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采血前24 h禁高脂高糖飲食。抽血時(shí)病人處于安靜狀態(tài)，空腹，取坐位。從肘正中靜脈用EDTA抗凝劑真空采血管抽取全血樣本7.5 mL。采血后重新編號(hào)，放入4 ℃冰箱暫存，24 h內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.3.2 免疫磁珠富集法 將收集的卵巢癌病人的外周血放至10 mL離心管中，置于離心機(jī)中，1 500 r/min離心15 min；離心后，轉(zhuǎn)移上面第一層和第二層內(nèi)所有液體至 10 mL離心管A中；在離心管A中加等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻；加入抗EpCAM免疫磁球，孵育1 h，每隔10 min混勻一次；將離心管放在磁力架上，磁分離15 min，丟棄上清，并加1 mL PBS洗滌磁球；滴加CK19-FITC 15 μL，CD45-PE 15 μL，DAPI 25 μL 37 ℃下避光孵育1 h。加2 mL PBS洗滌，磁分離15 min，加入50 μL雙蒸水重懸涂片；以對(duì)數(shù)正常生長的卵巢癌細(xì)胞株為陽性對(duì)照，以PBS代替抗體作為陰性對(duì)照。在熒光顯微鏡計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞數(shù)并記錄結(jié)果。

1.3.3 CTCs判定標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤細(xì)胞體積大于周圍白細(xì)胞，核較大或小，核漿比例較大，核分裂增多；在熒光顯微鏡下觀察，DAPI(+)、CK19(+)、CD45(-)為CTCs。

1.4 實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo) 纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)、D-二聚體(D-Dimer)、抗凝血酶-Ⅲ(Antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ)采用貝克曼ACL TOP700儀器加IL試劑盒檢測，血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)采用貝克曼LH750儀器檢測。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌病人CTCs檢測結(jié)果 對(duì)照組外周血中檢出CTCs為30.0%(6/20)，卵巢癌合并VET病人外周血中檢出CTCs為75.8%(47/62)，兩組陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 卵巢癌CTCs免疫熒光染色結(jié)果(見圖1)

圖1 CTCs免疫熒光染色結(jié)果

2.3 卵巢癌CTCs與各指標(biāo)的相關(guān)性 CTCs陽性率與上皮性卵巢癌病人的年齡、腫瘤部位、TNM分期及纖維蛋白原無關(guān)(P>0.05)；而與CA125、血小板數(shù)量及抗凝血酶Ⅲ密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 卵巢癌CTCs與各指標(biāo)的相關(guān)性 例

3 討 論

CTCs是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞統(tǒng)稱，由于自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落，大部分CTCs進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)轉(zhuǎn)移至其他器官發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶或形成局部血栓[8]。外周血腫瘤細(xì)胞是導(dǎo)致血栓的重要原因[9]。監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的變化成為人們研究的焦點(diǎn)。

大量文獻(xiàn)表明，CTCs與腫瘤的轉(zhuǎn)移和血栓形成有關(guān)[10-11]。病人CTCs水平越高，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越大，同時(shí)高水平循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs易形成血栓。卵巢癌病人監(jiān)測CTCs不僅可幫助臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，指導(dǎo)臨床化療藥物的應(yīng)用，還可及時(shí)預(yù)防復(fù)發(fā)和腫瘤性血栓[12]。

本研究觀察62例卵巢癌合并VET病人，47例為CTCs陽性，統(tǒng)計(jì)分析顯示，CTCs陽性率與上皮性卵巢癌病人的年齡、腫瘤部位、TNM分期及纖維蛋白原無關(guān)(P>0.05)；而與CA125、血小板數(shù)量及抗凝血酶Ⅲ密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果顯示，CTCs與卵巢癌病人血栓的風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)。本研究CTCs陽性率與病人的纖維蛋白原無關(guān)，而在實(shí)際臨床工作中，CTCs陽性率高及纖維蛋白原高的病人更易發(fā)生血栓，這可能與臨床樣本量較少有關(guān)。因此，CTCs與卵巢癌病人血栓可能性的相關(guān)性還需更多大樣本量及多中心的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，CTCs水平與卵巢癌病人栓塞密切相關(guān)。監(jiān)測外周血CTCs有望成為預(yù)測卵巢癌病人靜脈栓塞的可靠指標(biāo)。

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(本文編輯薛妮)

山西省婦幼保健院(太原 030001)

杜秀萍，E-mail：13835121498@163.com

信息：張玲，喬翠峰，杜秀萍.上皮性卵巢癌病人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與栓塞的相關(guān)性研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(17)：2219-2221.

R737.3 R271

：Bdoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.17.044

：1672-1349(2017)17-2219-03

2017-07-25)