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依達(dá)拉奉注射液對(duì)高膽紅素血癥腦損傷新生大鼠血清S100B蛋白水平的影響

申雅潔1，陰懷清2，曹芳芳2，賈曉君2

目的依達(dá)拉奉注射液干預(yù)后對(duì)高膽紅素血癥腦損傷新生大鼠血清S100B蛋白濃度的影響。方法將96只7 d齡SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)、高膽紅素血癥組(B組)、依達(dá)拉奉注射液干預(yù)組(C組)，每組根據(jù)處死時(shí)間分為4個(gè)亞組。給予B組、C組大鼠腹腔注入1次膽紅素，同樣方法給予A組大鼠注入1次生理鹽水，造模后C組大鼠立即腹腔注射依達(dá)拉奉注射液，最后在各時(shí)間點(diǎn)將各組大鼠血清及腦組織取出。采用HE染色法觀察腦組織的病理學(xué)改變，Elisa法測(cè)定血清S100B蛋白濃度，計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果造模后，明顯的神經(jīng)行為異常均出現(xiàn)在B組和C組大鼠，各時(shí)間點(diǎn)C組大鼠較B組癥狀明顯改善，A組大鼠行為無明顯異常。造模24 h后，B組、C組大鼠腦組織出現(xiàn)水平不一的水腫、變性及炎性浸潤(rùn)等，隨著時(shí)間延長(zhǎng)程度加重。各時(shí)間點(diǎn)C組大鼠腦組織改變程度較B組減輕，A組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)基本正常。B組大鼠血清S100B蛋白濃度高于A組、C組，與時(shí)間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組大鼠血清S100B蛋白濃度低于B組，高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論經(jīng)依達(dá)拉奉注射液干預(yù)后，不同時(shí)間點(diǎn)腦組織改變不同程度減輕，高膽紅素血癥大鼠血清S100B蛋白濃度明顯降低，表明依達(dá)拉奉注射液可減輕過量膽紅素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，起到保護(hù)神經(jīng)元作用。

高膽紅素血癥；腦損傷；依達(dá)拉奉注射液；S100B蛋白

黃疸是新生兒早期常見的臨床癥狀，多數(shù)較輕，約25/10萬的足月或近足月新生兒可發(fā)生較嚴(yán)重的高膽紅素血癥，輕者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的功能性損傷如聽覺系統(tǒng)損傷，重者可引起急性膽紅素腦病，造成嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，甚至危及生命[1-2]。高膽紅素血癥引起腦損傷早期無特異性臨床表現(xiàn)，多數(shù)新生兒出現(xiàn)典型癥狀前已發(fā)生神經(jīng)毒性損害，臨床需要客觀及敏感指標(biāo)判斷膽紅素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。本研究通過建立新生大鼠高膽紅素血癥動(dòng)物模型，研究高膽紅素血癥時(shí)使用依達(dá)拉奉注射液干預(yù)后大鼠血清S100B蛋白的水平，為高膽紅素血癥的診治及臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將96只7 d齡以Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(A組)、高膽紅素血癥組(B組)、依達(dá)拉奉注射液干預(yù)組(C組)。每組根據(jù)處死時(shí)間不同分為4個(gè)亞組：24 h組、48 h組、72 h組、96 h組，每個(gè)亞組8只大鼠。

1.2 注射用膽紅素溶液及依達(dá)拉奉注射液溶液配制 避光稱取4 mg膽紅素晶體，溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中，再加入雙蒸水9 mL，濃度為4 mg/mL，之后用0.5 mol/L HCl溶液將pH調(diào)至8.5，1 h內(nèi)使用。取1支20 mL(30 mg)依達(dá)拉奉注射液溶液，使用生理鹽水稀釋至200 mL，濃度為0.15 mg/mL，避光保存。

1.3 造模及方法 采用腹腔注射方法給予B組、C組大鼠按100 μg/g劑量注入1次膽紅素，采用同樣方法給予A組大鼠按同樣劑量注入1次生理鹽水，造模后C組大鼠立即腹腔注射依達(dá)拉奉注射液，劑量為2 mg/(kg·d)，持續(xù)4 d。

1.4 標(biāo)本制備 在不同時(shí)間點(diǎn)以5%水合氯醛將大鼠麻醉，將麻醉后大鼠固定于手術(shù)板上，逐一打開大鼠胸腔及腹腔，將心臟、肝臟充分暴露，以5 mL注射器小心刺入心臟跳動(dòng)最明顯處，抽取血液0.5 mL于干燥EP管中，靜置30 min后以3 000 r/min離心10 min，用1 mL注射器小心吸出上層血清，移至另一干燥EP管中，置-80 ℃冰箱內(nèi)保存用于檢測(cè)S100B蛋白，溶血標(biāo)本除外。

在肝臟下緣剪一長(zhǎng)約3 mm的小口，以20 mL注射器于心臟抽取血液同一位置刺入心臟，將生理鹽水注入左心室，進(jìn)行充分灌洗，當(dāng)肝臟下緣切口處有清亮液體流出時(shí)，再以20 mL～30 mL的10%多聚甲醛灌洗。灌洗結(jié)束后，將大鼠斷頭并剖出腦組織，采用生理鹽水清洗并以濾紙濾干水分，浸入10%多聚甲醛固定24 h，先行矢狀切，之后分別從視交叉及其后約4 mm處行冠狀切，將海馬區(qū)囊括其中，將組織塊行常規(guī)石蠟包埋，后將標(biāo)本不間斷冠切于切片機(jī)上，片厚約5 μm，放于載玻片，最后切片于70 ℃烤箱中過夜。將大鼠腦組織HE染色，鏡下(10×10)觀察組織形態(tài)并采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型行為觀察 實(shí)驗(yàn)前，B組、C組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)未見明顯異常，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，兩組大鼠皮膚黃染逐漸加重，對(duì)外界刺激的規(guī)避應(yīng)激反應(yīng)減弱，但各時(shí)間點(diǎn)C組大鼠行為學(xué)異常表現(xiàn)較B組顯著減輕。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，A組大鼠在行為學(xué)變現(xiàn)方面未見顯著異常。

2.2 HE染色觀察腦組織病理變化 造模24 h后，B組、C組大鼠腦組織出現(xiàn)水平不一的水腫、變性及炎性浸潤(rùn)等，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其程度有所加重。與B組比較，C組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織的水腫、變性及炎性浸潤(rùn)等改變程度減輕，A組大鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。詳見圖1。

A組24 h B組24 h C組24 h

A組48 h B組48 h C組48 h

A組72 h B組72 h C組72 h

A組96 h B組96 h C組96 h

2.3 各組大鼠血清S100B蛋白濃度比較 B組大鼠血清S100B蛋白濃度高于A組，且與時(shí)間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組大鼠血清S100B蛋白濃度低于B組，高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組大鼠血清S100B蛋白濃度，各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清S100B蛋白濃度比較(±s) pg/mL

3 討 論

黃疸是新生兒期常見的臨床癥狀之一，其程度不一。新生兒發(fā)生高膽紅素血癥后，過量的游離膽紅素通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性分為聚集、結(jié)合、沉淀三個(gè)步驟，前兩個(gè)步驟對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損害是可逆的，而沉淀的損害是不可逆的。膽紅素沉積在腦組織，引起一系列病理生理改變，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡，最終引起腦組織不同程度損壞[3-4]。由于高膽紅素血癥腦損傷早期無特異性臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致治療的滯后性，因此，及時(shí)處理新生兒高膽紅素血癥是預(yù)防高膽紅素血癥腦損傷的關(guān)鍵[5]。

依達(dá)拉奉注射液(edaravone，MCI-186)是一種具有捕獲羥自由基(·OH)的活性抗氧劑。有研究表明，依達(dá)拉奉注射液脂溶性高，易到達(dá)腦組織，對(duì)腦缺血具有強(qiáng)大的保護(hù)作用，是一種有效的腦神經(jīng)保護(hù)劑[6-7]。目前主要應(yīng)用于急性腦梗死、缺血缺氧性腦病及各種缺血再灌注損傷的治療，通過調(diào)節(jié)腦缺血后單胺類物質(zhì)代謝，清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化，調(diào)節(jié)腦缺血后花生四烯酸代謝，保護(hù)血管內(nèi)皮，對(duì)凋亡基因的影響保護(hù)神經(jīng)元[13]。

S100B蛋白是S100蛋白家族中最主要且最具活性的蛋白質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度特異表達(dá)，正常情況下不能通過血-腦脊液屏障(BBB)，血清S100B蛋白濃度維持極低水平，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和表達(dá)增加，導(dǎo)致S100B蛋白分泌，并從損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放，使腦脊液S100B蛋白水平升高。若BBB損傷，S100B蛋白可釋放到全身血液循環(huán)，檢測(cè)到血液S100B蛋白濃度升高。因此血清和腦脊液S100B蛋白濃度升高，是檢測(cè)腦損傷的重要神經(jīng)生化標(biāo)記物[14-15]。

有研究結(jié)果表明，當(dāng)患兒血清總膽紅素(TSB)≤191 μmol/L時(shí)，血清S100B蛋白穩(wěn)定維持在固定水平，當(dāng)膽紅素濃度進(jìn)一步增高時(shí)，患兒出現(xiàn)聽覺、腦電圖異常，其血清S100B蛋白顯著增高；高膽紅素血癥新生兒血清中S100B蛋白明顯高于正常新生兒，且輕中度高膽紅素血癥引起S100B蛋白顯著增高，與膽紅素水平呈正相關(guān)性[16]。故S100B蛋白可作為臨床診斷新生兒高膽紅素血癥腦損傷的敏感指標(biāo)，且與腦損傷程度有關(guān)。吳信真等[17]研究依達(dá)拉奉注射液對(duì)急性大面積腦梗死病人S100B蛋白水平影響，結(jié)果顯示對(duì)照組和治療組治療前S100B蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療10 d后兩組S100B蛋白水平較治療前均有下降，治療組低于對(duì)照組(P<0.05)[17]。表明大面積腦梗死后，由于腦組織缺血、缺氧、水腫及壞死等改變，導(dǎo)致神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷，同時(shí)由于BBB通透性增高或破壞，進(jìn)入血清中的S100B蛋白含量明顯增高，依達(dá)拉奉注射液治療后血清中S100B蛋白含量明顯下降[18]。在大鼠全腦缺血再灌注模型中，依達(dá)拉奉注射液組大鼠血清S100B蛋白含量較缺血再灌注組顯著降低(P<0.05)。關(guān)于依達(dá)拉奉注射液治療高膽紅素血癥腦損傷方面研究較少。

本研究結(jié)果顯示，高膽紅素血癥時(shí)，24 h后大鼠腦組織出現(xiàn)水腫、變性及炎性浸潤(rùn)等改變，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其程度有所加重；大鼠血清S100B蛋白濃度增高，與時(shí)間呈正相關(guān)。經(jīng)依達(dá)拉奉注射液干預(yù)后，不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織的水腫、變性及炎性浸潤(rùn)等有不同程度減輕，血清S100B蛋白濃度明顯降低，表明依達(dá)拉奉注射液通過減輕過量膽紅素對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，從而保護(hù)其神經(jīng)元。

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(本文編輯薛妮)

Effects of Edaravone Injection on Serum S100B Protein in Neonatal Rats with Hyperbilirubinemia Induced Brain Injury

Shen Yajie，Yin Huaiqing，Cao Fangfang，Jia Xiaojun

Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

ObjectiveTo explore the effects of edaravone injection on serum S100B protein in neonatal rats with hyperbilirubinemia induced brain injury.MethodsNinety-six seven-day-old Wistar Sprague-Dawley (SD) rats were randomly assigned into three groups:normal control group (group A)，hyperbilirubinemia group (group B)，and edaravone injection group (group C).Then each group was divided into 4 subgroups based on the time of execution.The rats in group B and group C were injected intraperitoneally with bilirubin.The rats in group A were injected intraperitoneally with normal saline once.After modeling，rats in group C were given intraperitoneal injection of edaravone injection.The serum and brain tissue were taken out at different time points.The pathological changes of brain tissue were observed by HE staining.The concentration of serum S100B protein was measured by Elisa method.ResultsAfter modeling，neurological abnormalities were observed in group B and group C.The symptoms of rats in group C had significantly improved compared with group B at each time point.After 24 hours of modeling，the edema，degeneration and inflammatory infiltration of brain tissue in group B and group C were aggravated with the prolongation of time.The changes of brain tissue in group C were lower than those in group B at each time point.The structure of brain tissue in group A was normal.The concentration of S100B protein in group B was higher than that in group A and group C，and positively correlated with time (P<0.05).The concentration of serum S100B protein in group C was lower than that in group B (P<0.05).ConclusionAfter intervention with edaravone injection，the changes of brain tissue in the hyperbilirubinemia rats at different time points were reduced to different degrees.The concentration of S100B protein was significantly decreased at different time points.The results indicated that edaravone injection could reduce the damage of excess bilirubin on central nervous system，and play a role in protecting neurons.

hyperbilirubinemia；brain injury；edaravone injection；S100B protein

山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No.2014-075)

1.山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)，E-mail：418824956@qq.com；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

信息：申雅潔，陰懷清，曹芳芳，等.依達(dá)拉奉注射液對(duì)高膽紅素血癥腦損傷新生大鼠血清S100B蛋白水平的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(17)：2116-2119.

R722.1 R256.4

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.17.009

：1672-1349(2017)17-2116-04

2017-01-15)