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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

DARPP-32磷酸化與止顫湯改善大鼠帕金森病運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的研究

黃寧靜，陸小青

目的觀察紋狀體多巴胺和環(huán)磷腺苷調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)(Thr34)磷酸化與止顫湯對大鼠帕金森病運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的影響。方法采用6-羥基多巴胺(6-OHDA)注射于大鼠腦部黑質(zhì)造成帕金森病(PD)模型，進(jìn)一步予以左旋多巴/芐絲肼腹腔注射制作異動(dòng)癥(LID)模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)立正常組，LID模型組，LID西藥組及小劑量中藥組、中劑量中藥組、大劑量中藥組，并采用免疫組化法觀察各組大鼠DARPP-32(Thr34)磷酸化的表達(dá)情況。結(jié)果免疫組化顯示，假手術(shù)組DARPP-32(Thr34)磷酸化表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01)。中藥小劑量組、中劑量組、大劑量組DARPP-32磷酸化表達(dá)與西藥組表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組磷酸化與小劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論止顫湯可有效降低紋狀體DARPP-32(Thr34)磷酸化的表達(dá)，可能是止顫湯治療異動(dòng)癥的機(jī)制。

帕金森?。恢诡潨?；異動(dòng)癥；多巴胺和環(huán)磷腺苷調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白-32

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是目前中老年的一種多發(fā)病，是一種以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢步態(tài)異常為主要臨床特征的疾病，已成為繼阿爾海默茨病后影響老年人心身健康的第二大神經(jīng)行性功能障礙疾病[1]。目前PD治療以左旋多巴為主的替代治療，長期使用左旋多巴，引起癥狀波動(dòng)和異動(dòng)癥(LID)，異動(dòng)癥是一種舞蹈樣、手足徐動(dòng)樣或簡單重復(fù)的不自主動(dòng)作，較多的中晚期病人因此致殘[2]。

LID發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，臨床上也未有推廣的治療藥物及技術(shù)，因此異動(dòng)癥是帕金森病運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的一個(gè)難關(guān)，故中醫(yī)藥治療異動(dòng)癥是一個(gè)切入點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，紋狀體環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴性蛋白激酶(PKA)通路和其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白多巴胺和環(huán)磷腺苷調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)蛋白Thr34位點(diǎn)磷酸化表達(dá)的改變可能參與異動(dòng)癥發(fā)病[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過采用止顫湯治療異動(dòng)癥大鼠，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠紋狀體DARPP-32(Thr34)磷酸化表達(dá)變化，旨在探討其治療LID的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠50只，體重180 g～220 g，由斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，經(jīng)反復(fù)行為檢測確認(rèn)無旋轉(zhuǎn)行為。

1.2 藥物配制 止顫湯為上海市中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)李如奎教授經(jīng)驗(yàn)方，由上海市中醫(yī)醫(yī)院提供，中劑量組藥物：黃芪15 g，丹參9 g，鉤藤18 g，知母12 g，白芍12 g，制大黃15 g，升麻9 g，水煎濃縮至每1 mL含生藥1.28 g。大小劑量組藥物劑量分別為在中劑量組基礎(chǔ)上增減20%，儲(chǔ)存于冰箱備用。

1.3 方法

1.3.1 PD大鼠模型制備 腹腔注射2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，平臥位固定于腦立體定位儀上。大鼠頭部局部常規(guī)消毒后，剪開頭皮，剝離骨膜，參照包新民等[5]所著大鼠腦立體定位圖譜確定左側(cè)黑質(zhì)致密部(SNC)和黑質(zhì)紋狀體通路(VTA)兩坐標(biāo)：①SNC前囟后5.0 mm，矢狀縫左側(cè)1.7 mm，顱骨表面下7.6 mm；②VTA前囟后4.6 mm，矢狀縫左側(cè)0.9 mm，顱骨表面下7.5 mm；并根據(jù)大鼠體重和頭顱大小在規(guī)定范圍內(nèi)確定具體坐標(biāo)并以三棱針進(jìn)行標(biāo)記，使用牙科鉆小心鉆透顱骨，按確定坐標(biāo)將微量注射器緩慢進(jìn)入預(yù)定深度，實(shí)驗(yàn)組向每個(gè)位點(diǎn)注射lactacystin 8 μg(4 μL)；對照組則注射等體積生理鹽水，深度以針孔斜面中點(diǎn)為參照點(diǎn)，以顱骨下硬腦膜處為零點(diǎn)，以1 μL/min速度緩慢旋轉(zhuǎn)推藥，注射完畢后留針10 min，緩慢退針，術(shù)后常規(guī)縫合傷口，連續(xù)腹腔注射青霉素[10×104U/(kg·d)]，持續(xù)1周預(yù)防感染，局部傷口每日碘酒消毒1次，7 d后拆線。術(shù)后1周起，每隔7 d 09：00檢測行為學(xué)，阿撲嗎啡(APO)0.5 mg/kg腹腔注射。在直徑為40 C1TI容器觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為。記錄注射后5 min大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，同時(shí)觀察其行為學(xué)變化，連續(xù)測試3周。若連續(xù)觀察30 min，大鼠恒定向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，平均轉(zhuǎn)速>7 r/min，視為成功PD模型大鼠；平均轉(zhuǎn)速<7 r/min的右轉(zhuǎn)鼠或左轉(zhuǎn)鼠；不轉(zhuǎn)鼠均被淘汰。

1.3.2 LID大鼠模型制備 采用6-羥基多巴胺(6-OHDA)制備PD模型大鼠[6]，2周后進(jìn)行行為學(xué)觀察：按0.5 mg/kg腹腔注射APO，記錄1 h內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)總?cè)?shù)，>100 r/h即為PD模型制作成功。同時(shí)隨機(jī)選取6只大鼠采用生理鹽水代替6-OHDA注射作為正常組(假手術(shù)組)。將左旋多巴和芐絲肼溶于含0.2%維生素C的消毒生理鹽水中，使左旋多巴終濃度為10 mg/mL，芐絲肼為2.5 mg/mL。3周后對造模成功的PD大鼠腹腔注射左旋多巴甲酯(按體質(zhì)量50 mg/kg)/芐絲肼(按體質(zhì)量12.5 mg/kg)4周，每日兩次(09：00與17：00)，制備LID大鼠模型[7]。隨機(jī)將LID模型分為：LID模型組、LID西藥組、中藥小劑量組、中藥中劑量組、中藥大劑量組，每組6只。LID模型組大鼠給予腹腔注射含0.2%維生素C的消毒生理鹽水，持續(xù)29 d；LID西藥組為腹腔注射左旋多巴甲酯/芐絲肼，每日兩次(09：00與17：00)，持續(xù)29 d；中藥小劑量組、中藥中劑量組、中藥大劑量組在給予左旋多巴甲酯/芐絲肼基礎(chǔ)上分別加用止顫湯灌胃，每日1次，持續(xù)29 d，每次灌胃量為9 mL/kg。

1.4 測試指標(biāo) 免疫組化檢測：石蠟包埋組織，常規(guī)切片，厚度4 μm，65 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，30 mL/L H2O2中封閉內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)抗原兔抗DARPP-32(Thr34)抗體，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min，DAM顯色劑顯色，脫水、干燥、封片，分別在光學(xué)顯微鏡下觀察。按下列公式計(jì)算：GRK6蛋白陽性細(xì)胞指數(shù)(IOD)：IOD=陽性細(xì)胞面積×校正吸光度(A)值，校正A值=A測量區(qū)-A背景。

2 結(jié) 果

各組大鼠免疫組化比較免疫組化顯示，假手術(shù)組DARPP-32(Thr34)磷酸化表達(dá)(3.89±0.13)×104，明顯低于模型組(8.65±0.35)×104(P<0.01)。西藥組磷酸化表達(dá)[(8.55±0.28)×104]與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中藥小劑量組、中劑量組、大劑量組DARPP-32磷酸化表達(dá)分別為(7.66±0.25)×104、(5.25±0.18)×104、(5.05±0.15)×104，與西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組磷酸化與小劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與大劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。

圖1 各組大鼠紋狀體區(qū)DARPP-32(Thr34)磷酸化表達(dá)

3 討 論

帕金森病是中老年人的常見疾病，其患病率隨年齡增長而逐漸增高，其病理改變主要出現(xiàn)在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，為黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性引起的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺遞質(zhì)含量顯著減少[8-9]。自20世紀(jì)60年代以來，左旋多巴一直是治療帕金森病有效的藥物之一，但長期使用左旋多巴，逐漸出現(xiàn)療效減退及運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥等不良反應(yīng)，其中最突出的運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥是LID[10]，許多中晚期病人因此致殘。

近年來有研究結(jié)果表明，LID發(fā)生與黑質(zhì)紋狀體的直接通路活性改變有關(guān)[11]。多巴胺和環(huán)磷腺苷調(diào)節(jié)的DARPP-32是直接通路上信號(hào)傳導(dǎo)的重要物質(zhì)，直接參與并調(diào)控直接通路的活化程度。Lundblad等[12]研究表明，長期使用左旋多巴治療PD大鼠，出現(xiàn)不自主運(yùn)動(dòng)(AIM)與人類LID行為相似，可作為模型研究LID機(jī)制。

DARPP-32是直接通路上重要的信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，大量集中于紋狀體區(qū)，直接參與并調(diào)控直接通路的活化程度[3，13]。多巴胺D1受體激活后，活化腺苷酸環(huán)化酶，生成cAMP，從而激活蛋白激酶(PKA)，PKA可促進(jìn)DARPP-32的Thr34位點(diǎn)磷酸化[4]，同時(shí)降低Thr75位點(diǎn)磷酸化。DARPP-32的Thr34位點(diǎn)磷酸化后成為蛋白磷酸酶1(PP-1)的高效抑制劑，后者可調(diào)控神經(jīng)元磷酸蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而激活直接通路。此外，DARPP-32的Thr75位點(diǎn)磷酸化后成為PKA抑制劑，其磷酸化程度降低可減輕對PKA的抑制作用，從而間接強(qiáng)化直接通路?？梢娏姿峄稽c(diǎn)不同，有對直接通路相反作用。有實(shí)驗(yàn)表明，異動(dòng)癥大鼠腦部紋狀體DARPP-32的Thr34位點(diǎn)磷酸化水平增高，可能造成直接通路過度活化，引起直接、間接通路的平衡失調(diào)及清除異常運(yùn)動(dòng)信息的功能破壞，最終導(dǎo)致LID發(fā)生[14]。

復(fù)方中藥具有多靶點(diǎn)，整體治療特點(diǎn)。中醫(yī)藥重視整體調(diào)理，中藥組方配伍靈活，對疾病可兼顧局部和整體，進(jìn)行綜合干預(yù)。治療帕金森病運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥也頗有療效。根據(jù)臨床表現(xiàn)和體征，PD屬于中醫(yī)“顫證”范疇[15]。早在《內(nèi)經(jīng)》中就有記載，《素問·至真要大論篇》曰：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，其病機(jī)通常認(rèn)為是本虛標(biāo)實(shí)，本虛是指肝腎精血不足與氣血虧虛，標(biāo)實(shí)常指痰熱夾風(fēng)陽為患，其病位在腦，與肝、脾、腎三臟有關(guān)。

止顫湯是我科上海市名老中醫(yī)李如奎教授，結(jié)合多年治療PD經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過探索篩選研制所得，在我科近幾十年臨床運(yùn)用于帕金森病及異動(dòng)癥病人頗有療效[16]。止顫湯由黃芪、丹參、鉤藤、知母、白芍、制大黃、升麻等組成。方中黃芪補(bǔ)氣，丹參、白芍活血補(bǔ)血，而《本草綱目》曰：“知母之辛苦寒涼，下則潤腎燥而滋陰，上則清肺金而瀉火”，白芍緩急、柔筋，知母養(yǎng)陰清熱，合鉤藤以奏熄風(fēng)平顫之功；大黃瀉濁火，使清陽之府靜謐；升麻升清陽，配伍黃芪等補(bǔ)氣之品，使清氣得升，腦髓得補(bǔ)。全方補(bǔ)氣血，滋腎陰，平肝風(fēng)，升清陽，瀉濁火，并可改善病人便秘、乏力諸癥。方中不少藥物兼有多種功效，如黃芪兼有補(bǔ)氣與熄風(fēng)之功，白芍兼有養(yǎng)血和止痙之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)白芍具有抗驚厥、解痙作用；升麻可清熱解毒；知母亦有鎮(zhèn)靜之能。李如奎教授指導(dǎo)下，已有國家及地方各級(jí)課題和多篇論文提示止顫湯對帕金森病大鼠模型有治療作用，并成功制作PD大鼠及LID大鼠模型[17]，因此該研究將止顫湯進(jìn)一步應(yīng)用于LID大鼠，旨在探索LID的發(fā)病機(jī)制及止顫湯的作用途徑。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紋狀體磷酸化DARPP-32(THr34)表達(dá)的免疫組化研究表明，正常組(假手術(shù)組)磷酸化表達(dá)明顯低于LID模型組(P<0.01)；而西藥組磷酸化與LID模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明LID時(shí)DARPP-32(THr34)表達(dá)有所增加；而中藥組治療后THr34磷酸化表達(dá)降低，提示中藥治療可降低磷酸化DARPP-32(THr34)的表達(dá)，抑制PKA通路的過度活化，緩解LID的進(jìn)一步加重。中藥中劑量組、大劑量組可顯著降低THr-34磷酸化表達(dá)，與小劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示與中劑量組比較，小劑量組降低磷酸化表達(dá)效果不如中劑量組，大劑量降低水平基本等同中劑量。

綜上所述，黑質(zhì)病變嚴(yán)重程度是LID發(fā)病基礎(chǔ)，而左旋多巴的波動(dòng)性刺激是其發(fā)病的始動(dòng)因素，直接和間接紋狀體輸出通路的失衡可能是異動(dòng)癥產(chǎn)生的主要病理機(jī)制[18-19]，而DARPP-32(THr34)水平的變化是直接通路過度活化的關(guān)鍵因素。因此止顫湯通過調(diào)控DARPP-32的磷酸化狀態(tài)或拮抗直接通路活性，逆轉(zhuǎn)通路活動(dòng)失衡有可能減輕LID癥狀。

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(本文編輯薛妮)

Effects of Zhichan Decoction on the Phosphorylation of DARPP-32 and Dyskinesia in Parkinsonian Rats

Huang Ningjing，Lu Xiaoqing

Shanghai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200434，China

Lu Xiaoqing

ObjectiveTo study the effects of Zhichan decoction (ZCD) on the phosphorylation of the dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of 32 kDa (DARPP-32) at Thr34 in striatum of Parkinsonian rats with abnormal involuntary movements (AIM).MethodsSix unilatera1 hydroxydopamine-lesioned rat，the mode1 of Parkinson disease (PD)，were treated with levodopa/benserazide in order to establish the rats models with levodopa-induced dyskinesia (LID).LID rats were randomly divided into 5 groups: LID model groups treated with saline，levodopa group and ZCD low doses group，ZCD medium doses group and ZCD high doses group，respectively.Five rats with sham-operation were served as controls.Rats were then sacrificed，and immunohistochemica1 techniques was used to measure the expression of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum.ResultsImmunohistochemistry showed that the expression of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum in LID model group was higher than that in control group (P<0.01).The expressions of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum in ZCD groups were lower than that in levodopa group (P<0.01).The expression of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum in ZCD medium doses group was lower than that in ZCD low doses group (P<0.05).ConclusionZCD can down-regulate the expression of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum in Parkinsonian rats with LID.

Parkinson’s disease；Zhichan decoction； dyskinesia；dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of 32 kDa

第五批上海中醫(yī)藥大學(xué)后備業(yè)務(wù)專家培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目；上海市衛(wèi)生局科教處青年項(xiàng)目(No.20134Y164)

上海市中醫(yī)醫(yī)院(上海 200434)

陸小青，E-mail：0917@szy.sh.cn

信息：黃寧靜，陸小青.DARPP-32磷酸化與止顫湯改善大鼠帕金森病運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(17)：2110-2113.

R742.5 R285.5

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.17.007

：1672-1349(2017)17-2110-04

2016-11-22)