盧曉聞，陳 哲，許烈鵬，鄭云貴，李欽喜，袁 軍

(汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科，廣東汕頭515041)

高壓氧聯合谷氨酰胺對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠神經功能和神經細胞凋亡情況的影響

盧曉聞，陳 哲，許烈鵬，鄭云貴，李欽喜，袁 軍

(汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科，廣東汕頭515041)

目的:觀察高壓氧(HBO)聯合谷氨酰胺(GLN)對創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)大鼠神經功能和神經細胞凋亡情況的影響，分析 HBO聯合 GLN治療 TBI的價值和可能機制．方法:將健康雄性SD大鼠(n=50)以Feeney自由落體法建立TBI模型，選取建模成功的大鼠(n=40)作為實驗動物，根據干預方式分為4組，即TBI組(普通腸內營養(yǎng)干預，n=10)、TBI+HBO組(普通腸內營養(yǎng)+高壓氧，n=10)、TBI+GLN組(谷氨酰胺腸內營養(yǎng)，n=10)、TBI+HBO+GLN組(谷氨酰胺腸內營養(yǎng)+高壓氧，n=10)．另選健康雄性SD鼠(n=10)作為健康組．干預后以平衡木實驗對大鼠神經功能進行客觀評價，用TUNEL法測定各組大鼠神經細胞的凋亡情況，分析組間神經功能和神經細胞凋亡水平的差異．結果:健康組大鼠神經功能評分(0．46±0．04分)、凋亡指數(0．37%±0．09%)顯著低于其他各組;TBI+HBO+GLN組大鼠神經功能評分(1．24±0．17分)、凋亡指數(8．83%±0．96%)顯著低于TBI組、TBI+GLN組、TBI+HBO組;TBI+HBO組大鼠神經功能評分(2．11±0．42分)、凋亡指數(13．71%±1．41%)顯著低于TBI組、TBI+GLN組;TBI+GLN組大鼠神經功能評分(2．96±0．64分)、凋亡指數(18．39%±1．65%)顯著低于TBI組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)．結論:HBO聯合GLN能夠改善TBI大鼠的神經功能，協(xié)同產生腦神經保護作用，其作用機制可能與二者能協(xié)同抑制神經細胞凋亡有關．

創(chuàng)傷性顱腦損傷;高壓氧;谷氨酰胺

0 引言

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)發(fā)生的主要原因為頭部遭受外力撞擊，其不僅是死亡率最高的腦外傷疾病之一，而且是后遺癥最多、最嚴重的顱腦疾病之一，TBI對患者的損傷極大．臨床實踐證實，TBI對顱腦的損害不僅局限于受傷瞬間，而且具有繼發(fā)性演變的特點，在傷后能導致顱腦組織持續(xù)惡化損傷．因此，傷后顱腦損害過程是該病的主要病理惡變階段．神經功能損傷、神經細胞凋亡壞死是繼發(fā)性顱腦損傷最常見的病理改變，因此，在該階段進行相關治療、阻止疾病惡化，對TBI的預后有重要價值．現有研究［1－3］發(fā)現，缺氧、營養(yǎng)不足是腦組織損傷惡化的主要促進因素，在繼發(fā)性腦損傷治療中及時糾正缺氧、給予充足的營養(yǎng)物質可能有益于患者預后．高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)、營養(yǎng)支持療法作為目前最主要的兩種措施［3－4］，在TBI綜合治療中備受爭議，且目前有關二者聯合治療的研究仍極為稀少．本研究在建立TBI模型的基礎上，通過動物實驗來初步觀察HBO聯合谷氨酰胺(glutamine，GLN)對顱腦損傷康復的價值，現報道如下．

1 資料和方法

1．1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，鼠齡20～22周，體質量210～230 g，均購自汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心．

1．2 試劑和儀器 高壓氧艙(NG90)寧波高壓氧艙總廠生產;原位細胞凋亡試劑盒(美國BD公司);纖維照相儀(BX41，日本OLYMPUS公司)、光學顯微鏡(SZ51，日本OLYMPUS公司);立體定向儀(51725，美國 STOELTING公司);石蠟切片機(a550，德國Leica公司);電子天平(HM-200，日本三洋公司)，微量進樣器(10 L，北京博奧森公司);谷氨酞胺(重慶藥友制藥公司);安素(美國雅培制藥公司)．

1．3 方法

1．3．1 TBI動物模型的建立 在胃造口術之后的第7天，成功制作顱腦損傷打擊設備后，往大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，按照Feeney操作法［5－6］通過自由落體裝置方式制作顱腦損傷動物模型，打擊裝置部件包括底座，固定架，套管(垂直)、落擊錘和撞擊墊，造模成功的標記為在自由落體撞擊后，被撞擊動物右側Horner征測定結果為陽性［7］．

1．3．2 動物分組 為了保證隨機分組和大鼠數目一致，選取50只健康大鼠進TBI模型制作，在成功建模的大鼠中，隨機選取40只平衡木實驗得分不低于3分的顱腦損傷大鼠作為實驗模型動物，按照隨機數字表法將其分成4組，并按照干預方案將4組進行區(qū)分，分別是TBI組(普通腸內營養(yǎng)干預，n=10)、TBI+ HBO組(普通腸內營養(yǎng)+高壓氧，n=10)、TBI+GLN組(谷氨酰胺腸內營養(yǎng)，n=10)、TBI+HBO+GLN組(谷氨酰胺腸內營養(yǎng)+高壓氧，n=10)．另選健康雄性SD鼠(n=10)作為健康組，不接受任何干預．

1．3．3 HBO治療 造模成功后的3 h之內，TBI+ HBO組、TBI+HBO+GLN組大鼠進入高壓艙接受HBO治療，氧艙型號均為NG90，給氧方式為直排式，氧濃度不低于98．5%，壓力為0．15 Mpa，穩(wěn)壓吸氧時間為60 min．連續(xù)治療14 d．

1．3．4 腸內營養(yǎng)干預 所有大鼠在造模后均接受營養(yǎng)支持治療，營養(yǎng)支持方式均為腸內營養(yǎng)，營養(yǎng)制劑均為安素，其中蛋白質占比14．2%，脂肪占比31．8%，碳水化合物占比54．0%，滲透壓濃度379 mOsm/L，熱量供給標準142．97 Kcal/kg．第一日半量補給，第二日開始全量補給，每日補給2次，連續(xù)7 d．TBI+GLN組、TBI+HBO+GLN組在給予安素腸內營養(yǎng)的同時，每日添加1．0 g/kg的GLN．兩組均連續(xù)干預14 d．

1．4 檢測指標

1．4．1 平衡木實驗 選一根長度1．0 m、寬度3．0 cm、厚度1．5 cm的橫木，將其水平放置在離地50 cm的空中，將大鼠依次通過懸空橫木，在造模前3 d對所選大鼠進行橫木通過訓練，確保大鼠可順利自行通過以后，開始試驗．放置橫木，使大鼠在其上順利行走．術前3 d開始訓練，保證大鼠均可以順利通過橫木．神經功能評分標準:0分:可自由穿過橫木，中途無跌倒;1分:能夠自行穿過橫木，有滑腳現象的路程在50%以下;2分:能穿過橫木，有滑腳現象的路程不低于50%;3分:能穿過橫木，且癱瘓肢無法向前移動; 4分:雖然無法穿過橫木，但能坐于橫木上;5分:在橫木上不能維持平衡．每只大鼠均測試3次，取平均值為結果［8］．

1．4．2 細胞凋亡檢測 干預之后對各組大鼠再次稱重，用水合氯醛腹腔麻醉后，將受試模型以仰臥位固定在實驗臺上．調試灌注裝置，常規(guī)開胸并分離心包，將心尖部心肌剪開，以左心室為起點，將灌注針頭插到升主動脈內，將灌注針頭固定，啟動灌注器，接通右心耳，將200 mL生理鹽水(37℃)快速灌注到循環(huán)系統(tǒng)中．將循環(huán)血液沖洗干凈后，即快速灌注150 mL多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(濃度4%，溫度40℃)，再緩慢灌注緩沖液(250 mL)，灌注2 h;灌注結束后，斷頭獲取損傷部位腦組織，健康組取相應部位組織，常規(guī)進行多聚甲醛磷酸鹽液固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石臘包埋后，以冠狀切片形式完成切片制作，每組均選6只鼠接受細胞凋亡檢測 ，細胞計數方法為TUNEL法，操作依據TUNEL試劑盒內所附帶的說明書．TUNEL陽性標準［9］是胞核為棕黃色．本研究中所有模型鼠均選取5個高倍鏡(400倍鏡下)進行陽性細胞計數，最終結果為5個視野的平均陽性數量，凋亡指數計算公式［10］為:凋亡指數=陽性細胞數/細胞總數×100%．

1．5 統(tǒng)計學處理 采用CHISS9．4統(tǒng)計學軟件對數據進行分析，計量資料用x ±s，多組間比較用單因素方差分析，多重比較用最小顯著差數法，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義．

2 結果

2．1 各組間大鼠神經功能評分結果比較 干預2周后，各組將死亡大鼠剔除后，進行平衡木實驗．5組大鼠平衡木測試結果顯示，健康組大鼠均能夠自行通過橫木，偶有滑腳現象出現．腦損傷各組均有模型鼠出現了明顯滑腳現象，TBI組模型鼠平衡木評分最高，其次為TBI+GLN組，TBI+HBO組和TBI+HBO+GLN組評分相對較低，尤其是TBI+HBO+GLN組評分集中在1～2分．多重比較結果顯示，健康組、TBI組、TBI+ GLN組、TBI+HBO組、TBI+HBO+GLN組神經功能評分差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，表1、2)．

表1 各組間大鼠神經功能評分結果比較 (x ±s)

表2 多重比較結果顯示

2．2 各組間大鼠神經細胞凋亡情況比較 干預2周后，各組的標本切片經過TUNEL法對凋亡神經細胞進行計數后，均按照公式完成了凋亡指數計算．本研究中各組均發(fā)現凋亡神經細胞的存在，但是腦損傷各組神經細胞凋亡更嚴重，其中TBI組凋亡神經細胞最多，其凋亡指數最高，然后依次為TBI+GLN組、TBI+ HBO組、TBI+HBO+GLN組，健康組神經細胞凋亡指數最低．多重比較結果顯示，健康組、TBI組、TBI+ GLN組、TBI+HBO組、TBI+HBO+GLN組凋亡指數差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，表3、4)．

表3 各組間大鼠凋亡指數計算結果 (n=6，x ±s，%)

表4 多重比較結果顯示

3 討論

TBI被認為是創(chuàng)傷疾病中死亡率最高的類型．雖然現代醫(yī)療技術不斷進步，急救效果不斷提高，但顱腦損傷死亡風險卻無明顯降低．另外，雖然絕大多數顱腦損傷患者無生命危險，但往往存在神經功能損傷的后遺癥，這對患者生活質量影響極大．因此，積極提升TBI患者的預后、改善神經功能、降低死亡率一直受到臨床醫(yī)生的重視．研究發(fā)現，TBI的患者多存在缺血缺氧、營養(yǎng)缺乏的現象，加之神經細胞凋亡導致繼發(fā)性腦損傷，這些因素是疾病惡化的主要原因．雖然細胞凋亡屬于正常的細胞死亡形式，其與機體細胞自殺程序有關，但現有研究［11－12］證實，顱腦損傷后神經細胞凋亡對顱腦損傷繼發(fā)性損傷演變過程具有重要影響，而干預神經細胞凋亡對神經功能、預后效果改善有重要作用．

眾所周知，神經細胞的存活及功能與氧具有密切關系，加之神經細胞具有高度氧依賴性，腦內能量代謝過程全部屬于有氧代謝，因此，一旦腦組織缺氧，氧儲備量減少，腦組織代謝過程將會出現明顯障礙，生物能量區(qū)域衰竭，這會導致腦組織血液、能量循環(huán)終止，神經細胞則開始凋亡．因此，通過外源性提高氧濃度，有利于挽救具有潛在凋亡風險的神經細胞．HBO治療是目前新型外源性提高氧濃度的方式，且國內外研究［13－15］均已證實高壓氧療法能夠提高腦外傷治療的效果．神經細胞凋亡不僅與氧濃度相關，而且與營養(yǎng)水平關系密切．顱腦損傷發(fā)生后，基于缺血缺氧狀態(tài)，糖代謝、脂代謝等均發(fā)生異常改變，體內血糖水平迅速提升后，腦損害程度加重，并誘發(fā)細胞酸中毒．此外，顱腦損傷后，內脂質過氧化效應增強，氧自由基生成水平提升，也能夠對神經細胞產生毒害作用．相關研究顯示營養(yǎng)支持療法對于顱腦損傷康復具有重要意義．它不僅能夠改善患者營養(yǎng)水平，而且部分營養(yǎng)素能通過刺激免疫細胞產生免疫調節(jié)作用，增強機體抗感染能力，最終提升患者預后．GLN作為氨基酸、核酸、蛋白質復合底物，是目前公認的免疫型營養(yǎng)素［16－17］．其不僅能夠發(fā)揮類葡萄糖作用(供能)，而且其作為核酸合成前體，是免疫細胞、組織細胞獲得能量的源泉．在損傷狀態(tài)下，機體對GLN的需求大幅升高，及時補充GLN能夠防止腸黏膜屏障受損，維持免疫功能，對顱腦損傷預后具有促進作用［18］．雖然目前關于HBO聯合GLN治療顱腦損傷的價值已被證實［19］，但是在細胞層次的作用機制研究卻較為少見，因此本研究立足于細胞學研究層次，通過分析神經功能、神經細胞凋亡情況初步分析HBO聯合GLN治療TBI的效果和可能機制．

本研究結果顯示，健康組神經功能評分、凋亡指數最低，其中凋亡指數并非為0，說明在正常情況下，神經細胞由于自殺程序也可發(fā)生凋亡，這與細胞周期變化、除舊生新有關．顱腦損傷各組神經功能評分、凋亡指數均明顯高于健康組，說明顱腦損傷能夠導致神經功能缺損，加大神經細胞凋亡幅度．經過干預，TBI+HBO+GLN組神經功能評分、凋亡指數均低于TBI組、TBI+GLN組、TBI+HBO組，且TBI+HBO組與TBI+GLN組神經功能評分、凋亡指數均低于TBI組，說明與常規(guī)腸內營養(yǎng)支持相比，加用GLN或者HBO均能夠提升神經功能恢復效果，但是HBO聯合GLN對于神經細胞凋亡的阻滯效果更佳，考慮其機制可能有幾下幾點:①GLN具有抗炎作用，能夠對炎癥因子進行直接抑制;②GLN能夠促進谷胱甘肽生成，提升氧自由基清除效果，從而發(fā)揮神經保護作用;③HBO能夠對細胞間黏附分子、血管細胞黏附分子、白介素等產生抑制作用，減輕炎癥反應，提高腦組織中氧濃度，從而減輕腦損傷;HBO能穩(wěn)定細胞內Ca2+濃度，能夠預防鈣超載、氨基酸興奮性異常增加而引發(fā)的神經細胞壞死，并且能夠促進骨髓間充質干細胞向成熟神經細胞分化;HBO提高椎基底動脈血供，阻斷腦缺血-水腫循環(huán)，激活上行網狀激活系統(tǒng)［20］．HBO治療能夠改善腦部血流動力學指標，增加腦部血供，有利于改善腦組織營養(yǎng)水平．由于本研究尚未對不良反應進行觀察，且屬于動物實驗階段，關于HBO聯合GLN的臨床價值仍有待深究．HBO聯合GLN能夠改善TBI患者神經功能，其作用機制可能為二者可聯合抑制神經細胞凋亡．

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Effect of hyperbaric oxygen combined with glutamine on neurological function and neuronal apoptosis in traumatic brain injury of rats

LU Xiao-Wen，CHEN Zhe，XU Lie-Peng，ZHENG Yun-Gui，LI Qin-Xi，YUAN Jun
Department of Neurosurgery，First Affiliated Hospital of Medical College，Shantou University，Shantou 515041，China

AIM:To investigate the effect of hyperbaric oxygen (HBO)combined with glutamine(GLN)on neurological function and neuronal apoptosis in traumatic brain injury(TBI)in rats and analyze their value and potential mechanisms in the treatment of TBI．METHODS:Fifty healthy male adult SD rats were used to establish TBI model by the free-fall method and forty of them were selected into the experiment．Selected rats were randomly divided into 4 groups:the TBI group(n=10)，the TBI+HBO group(n= 10)，the TBI+GLN group(n=10)，and the TBI+HBO+GLN group(n=10)．In addition，10 healthy adult male SD rats were picked as healthy group．After intervention，the neurological function of the rats was evaluated by beam balance test，and the neuronal apoptosis of rats was evaluated by in situ end labeling(TUNEL)．The difference on neurological function and neuronal apoptosis of different groups were compared and analyzed．RESULTS:The neurological function score(0．46±0．04)and the neuronal apoptosis rate(0．37%±0．09%)in healthy group were significantly lower than that of other groups(all P＜0．01);The neurological function score(1．24±0．17)and the neuronal apoptosis rate(8．83%± 0．96%)in TBI+HBO+GLN group were significantly lower than that of TBI group，TBI+GLN group and TBI+HBO group(all P＜0．01);The neurological function score(2．11±0．42)and the neuronal apoptosis rate(13．71%±1．41%)in TBI+HBO group were significantly lower than that of TBI group and TBI+GLNgroup(all P＜0．01);The neurological function score(2．96± 0．64)and the neuronal apoptosis rate(18．39%±1．65%)in TBI+ GLN group were significantly lower than that of TBI group，with statistically significant differences(P＜0．01)．CONCLUSION: HBO combined with GLN could effectively improve neurological function and protect neurons in the treatment of TBI，which may be related to synergistic inhibition of neuronal apoptosis．

traumatic brain injury;hyperbaric oxygen;glutamine

R459．6;R651．1+5

A

2095-6894(2017)08-29-05

2017－06－19;接受日期:2017－07－08

廣東省自籌經費類科技計劃項目(2016ZC0167)

盧曉聞．碩士，主治醫(yī)師．研究方向:腦血管病、腦腫瘤、腦外傷．E-mail:evanlxw@163．com

陳 哲(并列第一作者)．研究生．研究方向:腦血管病、腦腫瘤、腦外傷．E-mail:17246622@qq．com

袁 軍．博士，副主任醫(yī)師，副教授．研究方向:腦血管病、腦腫瘤、腦外傷．E-mail:yjun116@163．com