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(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550001)

顯齒蛇葡萄種皮中花色苷及多糖體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

楊麗麗,石治敏,焦思棋,吳少錦,鄒榮燦,余正文*

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550001)

顯齒蛇葡萄種皮,花色苷,多糖,抗氧化活性

顯齒蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W. T. Wang]為葡萄科顯齒蛇葡萄屬植物[1],具有清熱解毒、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨等功效[2]。顯齒蛇葡萄嫩葉經(jīng)殺青、揉捻、烘干而成的類茶飲料藤茶,具有消炎、鎮(zhèn)疼、止咳、祛痰、降血壓、降脂、抗腫瘤和保肝護(hù)肝的功效[3]?；ㄉ帐菑V泛存在于自然界中的一種植物色素,作為天然食用色素,無(wú)毒、無(wú)害,資源豐富,具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用,在食品、化妝品、醫(yī)藥領(lǐng)域都有巨大的應(yīng)用價(jià)值[4]。多糖分布于自然界高等植物、藻類、微生物與動(dòng)物體內(nèi),是生物有機(jī)體的重要組成成分,具有抗氧化[5-6]、抗病毒[7-8]、抗腫瘤[9]以及免疫調(diào)節(jié)活性。

目前,所用的抗氧化劑大多為人工合成,對(duì)人體具有潛在的危害[10]。天然抗氧化劑來(lái)源于植物,無(wú)毒無(wú)害,安全可靠?；ㄉ铡⒍嗵蔷哂锌寡?增強(qiáng)免疫活性,抗衰老等作用[11-12],可作為天然抗氧化劑。國(guó)內(nèi)外主要集中于對(duì)顯齒蛇葡萄葉花色苷、多糖的提取分離、穩(wěn)定性分析及生物活性等方面的研究[13-14],對(duì)種皮的研究鮮有報(bào)道。本文測(cè)定顯齒蛇葡萄種皮中花色苷、多糖的含量,并測(cè)定其體外抗氧化活性,為顯齒蛇葡萄種皮后續(xù)綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

顯齒蛇葡萄種皮 1號(hào)為原產(chǎn)地母株果實(shí)(貴州省貞豐縣挽瀾鄉(xiāng)窯上村,海拔:1299 m),2～4號(hào)均為母株扦插后栽培1年的子株果實(shí)(貴州省興仁縣新龍場(chǎng)鎮(zhèn)大屯村科研基地,海拔:1434 m),-18 ℃保存?zhèn)溆?維生素C 青島賀陽(yáng)化玻有限公司;硫酸亞鐵 濟(jì)寧宏明化學(xué)試劑有限公司;30%的雙氧水溶液 天津市東麗區(qū)華明街北于堡工業(yè)小區(qū);水楊酸 成都聯(lián)禾化工醫(yī)藥有限責(zé)任公司;EDTA 重慶化學(xué)試劑總廠;三羥甲基氨基甲烷 南京化學(xué)試劑總廠;鹽酸 廣西浙創(chuàng)化工有限公司;連苯三酚 湖南洪江棓雅生物科技有限公司;DPPH 合肥博美生物科技有限公司;葡萄糖 天津市魯鑫化工科技有限公司；以上試劑 均為分析純。

KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;分析天平(十萬(wàn)分之一) 梅特勒一托利多儀器有限公司;超純水系統(tǒng) LAB-BIOGEN倍捷科技;電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;EYELA N1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BIOGEN倍捷科技;UV759CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 顯齒蛇葡萄種皮花色苷、多糖的提取 顯齒蛇葡萄種皮分別為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)共四個(gè)樣品。

1.2.1.1 花色苷的提取 分別稱取顯齒蛇葡萄種皮樣品15.0000 g,加入150 mL提取劑(V乙醇∶V鹽酸∶V水=60∶1∶39),于35 ℃下浸提2 h,抽濾,減壓濃縮得浸膏[15],50 mL容量瓶定容,待用。

1.2.1.2 多糖的提取 分別稱取顯齒蛇葡萄種皮樣品15.0000 g,加適量石油醚加熱提取2 h,抽濾得脫脂種皮。按1∶10的料液比加蒸餾水,功率250 W超聲提取30 min,重復(fù)超聲提取3次,合并濾液,減壓濃縮得浸膏[16],50 mL容量瓶定容,待用。

1.2.2 花色苷含量測(cè)定 采用pH示差法[17]測(cè)定花色苷含量。分別用KCl-HCl緩沖液(0.025 mol/L,pH=1.0)和乙酸鈉-HCl緩沖液(0.4 mol/L,pH=4.5)稀釋至適當(dāng)倍數(shù)(使pH=1.0時(shí)的吸光度在0.2～0.7之間),放置 15 min后,于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算公式如下:

花色苷含量(mg/100 g)

式中:449.29是矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(g/mol);DF是稀釋倍數(shù);V是提取溶劑的體積(mL);26900是矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)(L·mol/cm);m是顯齒蛇葡萄的質(zhì)量(g);1是比色皿的光路長(zhǎng)度(cm)。

1.2.3 多糖含量的測(cè)定

1.2.3.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用紫外可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定多糖含量。精密吸取0.2031 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL分置于具塞試管中,加蒸餾水至體積為2.0 mL,再加5%的苯酚1.0 mL,迅速搖勻后滴加濃硫酸5.0 mL,置沸水浴中加熱15 min,取出冷卻至室溫。于490 nm處測(cè)吸光度,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)得標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程:A=12602c+0.0459,R2=0.9998。式中:A為多糖的吸光度;c為多糖濃度,mg/mL。

1.2.3.2 多糖含量測(cè)定 精密量取多糖提取液,稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度(0.01、0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/g),按照1.2.3.1方法測(cè)定。

1.2.4 羥自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18],向試管中依次加入2.0 mL、6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、2.0 mL不同濃度(0.01、0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/g)的花色苷、多糖或 VC溶液,2.0 mL、6 mmol/L雙氧水溶液,混勻,靜置10 min。再2.0 mL、6 mmol/L水楊酸溶液,混勻,靜置30 min,測(cè)定其在510 nm 處的吸光值A(chǔ)樣品;以蒸餾水取代水楊酸溶液,測(cè)定A對(duì)照;以蒸餾水取代花色苷、多糖溶液或 VC溶液,測(cè)定A空白。

1.2.6 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[20],取2.0 mL、不同濃度(0.01、0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/g)花色苷、多糖或VC溶液分別與2.0 mL的 DPPH·乙醇溶液(0.2000 mmol/L)、蒸餾水混合均勻,室溫避光靜置1 h,測(cè)定其在517 nm處的吸光值A(chǔ)樣品和A空白;再將2.0 mL DPPH·乙醇溶液與等體積蒸餾水混勻,以相同方法測(cè)定A對(duì)照。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別由Excel,Origin 9.0和SPSS軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1花色苷、多糖含量

經(jīng)測(cè)定1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)四個(gè)樣品的花色苷含量分別為0.79、1.05、1.35、1.02 mg/g;多糖含量分別為106.3、101.5、91.2、99.9 mg/g。研究表明,一般隨海拔高度的增加,紫外線加強(qiáng),果實(shí)著色度和著色率明顯提高[21]。而多糖的代謝積累與海拔高度關(guān)系要復(fù)雜些,如人參多糖的量隨海拔的升高而增加(100～800 m);人參多糖的量隨海拔的升高而減少(1200～1450 m)[22]。本研究的海拔高度內(nèi)(1200～1450 m),花色苷含量隨海拔高度的增加而增加;多糖的含量隨海拔高度的增加而減小。

2.2羥自由基清除能力

顯齒蛇葡萄花色苷、多糖提取物對(duì)·OH的清除能力見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 花色苷對(duì)羥自由基清除能力Fig.1 Scavenging activity of anthocyanins to hydroxy radical

圖2 多糖對(duì)羥自由基清除能力 Fig.2 Scavenging activity of polysaccharides to hydroxy radical

從圖1、圖2可以看出:在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),顯齒蛇葡萄花色苷、多糖提取物對(duì)·OH均有清除能力,且隨著濃度的增加,清除率也隨之增加,都低于VC。且花色苷、多糖含量越高,·OH清除能力越強(qiáng)。

2.3超氧陰離子自由基清除能力

圖3 花色苷對(duì)超氧陰離子自由基清除能力 Fig.3 Scavenging activity of anthocyanins to superoxide

圖4 多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力Fig.4 Scavenging activity of polysaccharides to superoxide

2.4 DPPH自由基清除能力

顯齒蛇葡萄花色苷、多糖提取物對(duì)DPPH·的清除能力見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 花色苷對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.5 Scavenging activity of anthocyanins to DPPH radical

圖6 多糖對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.6 Scavenging activity of polysaccharides to DPPH radical

從圖5、圖6可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),顯齒蛇葡萄花色苷、多糖提取物對(duì)DPPH·均有清除能力,且隨著濃度的增加,清除率也隨之增加,均高于VC。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí),清除率均高于80%;且花色苷、多糖的含量越高,DPPH·的清除能力越強(qiáng)。

2.5花色苷、多糖含量及各模型的IC50值

表1 花色苷、多糖含量及各模型的IC50值Table 1 Contents of anthocyanins and polysaccharides and value of IC50 of each model

2.6花色苷、多糖含量與IC50值的相關(guān)性分析

花色苷含量與羥基自由基的IC50值和超氧陰離子自由基的IC50值在0.05水平上顯著相關(guān),與DPPH自由基的IC50值在0.01水平上顯著相關(guān);多糖含量與羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的IC50值相關(guān)性不顯著。

表2 花色苷、多糖含量與IC50值相關(guān)性(Pearson系數(shù))Table 2 Correlation of the content of anthocyanin and polysaccharide and IC50value(coefficient of pearson)

注:**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān);*表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論

本研究首次測(cè)定顯齒蛇葡萄種皮中花色苷、多糖含量,對(duì)花色苷、多糖進(jìn)行清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基能力測(cè)定,并與VC對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)花色苷、多糖的體外抗氧化能力。當(dāng)花色苷、多糖的濃度在0.01～2.00 mg/mL范圍時(shí),其清除自由基能力與濃度存在量效關(guān)系;花色苷與DPPH自由基清除活性之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01);顯齒蛇葡萄種皮花色苷、多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于VC,顯示出較好的抗氧化活性,可用于開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑。

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EvaluationofantioxidantactivityinvitroofanthocyaninsandpolysaccharidesintheseedcoatofAmpelopsisgrossedentata

YANGLi-li,SHIZhi-min,JIAOSi-qi,WUShao-jin,ZOURong-can,YUZheng-wen*

(School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

seed coat ofAmpelopsisgrossedentata;anthocyanins;polysaccharides;antioxidant activity

2016-12-20

楊麗麗(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：藥用植物的開(kāi)發(fā)與利用，E-mail:18198217620@163.com。

*通訊作者:余正文(1973-)，男，博士，教授，研究方向：藥用植物的開(kāi)發(fā)與利用，E-mail:yuzhengwen2001@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460068)；貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(黔教合KY字[2015]335)。

TS255

:A

:1002-0306(2017)16-0065-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.013