周冷瀟， 韓 濤， 劉保文， 高英堂， 韓海燕

(1 天津醫(yī)科大學三中心臨床學院， 天津市第三中心醫(yī)院 肝內科， 天津市人工細胞重點實驗室，天津市肝膽疾病研究所， 天津 300170； 2 天津市河東區(qū)口腔醫(yī)院， 天津 300171)

肝硬化及肝細胞癌患者腸道微生態(tài)組成和結構的初步分析

周冷瀟1， 韓 濤1， 劉保文1， 高英堂1， 韓海燕2

(1 天津醫(yī)科大學三中心臨床學院， 天津市第三中心醫(yī)院 肝內科， 天津市人工細胞重點實驗室，天津市肝膽疾病研究所， 天津 300170； 2 天津市河東區(qū)口腔醫(yī)院， 天津 300171)

目的比較分析肝硬化和肝硬化基礎上發(fā)生肝細胞癌(HCC)的患者遠端腸道菌群的差異，探討肝硬化患者發(fā)生HCC與腸道菌群變化的關系。方法收集2015年12月-2016年5月天津市第三中心醫(yī)院肝內科住院的慢性肝病患者35例，包括20例肝硬化患者(肝硬化組)和15例肝硬化合并HCC患者(HCC組)。收集患者糞便標本，提取其腸道細菌總DNA，采用Roche 454測序技術對16S rDNA V3-V6可變區(qū)測序，并進行生物信息分析(物種分類、豐度分析及多樣性分析)。計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。結果20個肝硬化患者樣品平均OTU為306.50±163.76，15個HCC患者樣品平均OTU為357.24±168.85，2組患者OTU及alpha多樣性指數(shù)相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。糞便菌群序列包括的菌門主要有放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。屬種定量及組成分析發(fā)現(xiàn)，肝硬化組和HCC組患者腸道內多種細菌的相對豐度差異顯著，其中肝硬化組腸道菌群與HCC組比較，放線菌門(0.21% vs 0.06%，U=89.000，P=0.043)、雙歧桿菌屬(0.16% vs 0.04%，U=90.000，P=0.046)和梭菌屬(0.13% vs 0.08%，U=90.000，P=0.046)所占比例顯著升高，理研菌科(0.58% vs 2.30%，U=82.000，P=0.023)和Christenellaceae科(0.01% vs 0.08%，U=84.500，P=0.028)所占比例顯著降低。結論與單純肝硬化患者相比，肝硬化基礎上發(fā)生HCC者腸道菌群的組成有顯著差異，但這些差異與肝硬化基礎上發(fā)生HCC之間相互作用的具體機制尚不明確。

肝硬化； 癌， 肝細胞； 腸桿菌科

肝硬化是常見的消化系統(tǒng)疾病之一。肝細胞癌(HCC)是我國常見惡性腫瘤之一，其病死率高居惡性腫瘤第二位，是我國社會及醫(yī)療的沉重負擔[1]。人體胃腸道是一個代謝和免疫系統(tǒng)，也包含著最復雜的人體微生態(tài)系統(tǒng)。近年來已有多個研究[2-4]提示人類腸道菌群與肝硬化的發(fā)展密切相關。高通量測序技術又稱為第二代測序技術，以數(shù)據產出通量高為最大特點，在微生物學中廣泛應用。16S rDNA基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，由于其分子大小適中、突變率小，是細菌系統(tǒng)分類學研究中最常用和有效的標志。本研究采用高通量16S rDNA測序技術及生物信息分析方法，對人類肝硬化和HCC腸道菌群結構的差異和特征進行了分析。

1 資料和方法

1.1 研究對象 收集2015年12月-2016年5月天津市第三中心醫(yī)院肝內科住院的慢性肝病患者35例，根據是否合并HCC分為肝硬化組(20例)和HCC組(15例)。肝硬化診斷符合影像學檢查(腹部超聲、腹部超聲造影、腹部CT)結果，HCC診斷符合影像學檢查(腹部增強CT、腹部增強MRI)、實驗室檢查(血清AFP)和(或)肝穿刺活組織檢查結果，診斷標準參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》[5]。所有入選的肝硬化合并HCC患者均首次確診為HCC，在采樣之前未進行過射頻消融、介入、生物治療等針對HCC的治療。所有患者均未合并炎癥性腸病等胃腸道疾病、其他感染性疾病及糖尿病等其他代謝相關疾病，采樣前2周未使用或服用抗生素、微生態(tài)制劑、酸奶等益生菌、類固醇等激素、中草藥制劑。

1.2 研究方法

1.2.1 糞便標本的留取及提取細菌總DNA 所有患者的糞便樣品在排出后放入無菌標本盒，立即置于0 ℃環(huán)境下，24 h內置于-80 ℃環(huán)境下，冰凍狀態(tài)下使用北京艾德萊生物科技有限公司糞便基因組DNA快速提取盒(DN23)提取DNA，步驟如下：(1)細胞的裂解與破碎：取約200 mg糞便加入緩沖液；(2)去除細胞碎片、蛋白質和研磨物；(3)使用常規(guī)RNA酶消化方法處理RNA。DNA標本于冷藏條件下送至天津生物芯片技術有限公司進行測序及生物信息分析。

1.2.2 16S rDNA測序 對糞便DNA樣本進行純化后，采用Roche 454測序技術對樣本16S rDNA V3-V6可變區(qū)高通量測序。

1.3 生物信息分析

1.3.1 物種分類與豐度分析 對原始測序數(shù)據處理后獲取用于分析的數(shù)據，使用QIIME (quantitative insights into microbial ecology)[6]軟件對數(shù)據進行處理，將相似度在97%以上的序列聚類成一操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)，OTU的數(shù)量初步說明該份樣品的物種豐度；之后在每一OTU中選擇一序列與greengenes數(shù)據庫(13_5)[7]進行比對，完成物種組成和分類分析，可在界、門、綱、目、科、屬水平明確每一OTU的成分。

1.3.2 多樣性分析 利用QIIME[6]軟件計算針對單個樣品物種多樣性分析的alpha多樣性指數(shù)，包括chao1指數(shù)、simpson指數(shù)、shannon指數(shù)、gini指數(shù)等。

2 結果

2.1 一般資料 35例患者中男25例，女10例，年齡42～81歲，平均(57.80±10.04)歲。肝硬化組中男11例，女9例，年齡(54.80±8.64)歲，肝硬化病因為乙型肝炎7例、丙型肝炎1例、自身免疫性肝病4例、酒精性肝病4例、乙型肝炎合并酒精性肝病2例、非酒精性脂肪性肝病1例、隱源性1例；Child-Pugh分級A級12例、B級7例、C級1例。HCC組中男14例，女1例，年齡(61.80±10.67)歲，肝硬化病因為乙型肝炎8例、丙型肝炎1例、乙型肝炎合并酒精性肝病4例、隱源性2例；Child-Pugh分級A級6例、B級9例。

2.2 多樣性分析 35份糞便細菌DNA樣品共產生原始測序數(shù)據為583 662條，經過對原始序列進行質量、長度等過濾，得到最終可以用于分析的序列為470 041條。如表1所示，20個肝硬化患者樣品OTU數(shù)量為77～529，平均306.50±163.76；15個HCC患者樣品OTU數(shù)量為21～718，平均357.24±168.85。2組患者OTU及alpha多樣性指數(shù)相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

按97%相似度對樣本進行OTU分類，構建稀有曲線(圖1)。如圖所示稀有曲線沒有變平緩的趨勢，表明隨著測序條數(shù)的增加，仍然出現(xiàn)新的OTU，表明本實驗的測序深度未達到平臺期。2組患者稀有曲線的增長趨勢沒有顯著差異。

圖1 97%相似度的稀有曲線

2.3 主成分分析 對肝硬化患者與HCC患者在門水平上進行細菌主成分分析，發(fā)現(xiàn)二者可以較好地區(qū)分開(圖2)。提示2組患者腸道菌群在門水平上有一定差異。

圖2 2組患者腸道菌群門水平上的主成分分析

2.4 序列分類比較

應用rdp分類軟件進行序列比對分析，結果顯示糞便菌群序列包括的菌門主要有放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，此外部分樣品含有極微量的藍細菌門(Cyanobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)等。

2.4.1 2組患者腸道菌群門水平比較 如表2所示，在門水平上，肝硬化組患者腸道菌群中的放線菌門所占比例比HCC組顯著增加(P=0.043)；其余幾組菌門在2組間所占比例差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

表2 2組患者門水平主要細菌平均占比情況(%)

2.4.2 2組患者腸道菌群綱至屬水平比較 如表3所示，所列出的細菌在2組患者腸道菌群所占比例差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；其余細菌在2組患者腸道菌群所占比例差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

3 討論

人體胃腸道表面定植的細菌數(shù)約為1013～1014[8]，包括400種不同種和亞種的細菌[9]，腸道包含著最復雜的人體微生態(tài)系統(tǒng)，是人體最大的細菌和內毒素池[10]。正常人體腸道屏障包括腸道菌群的正常組成和分布、腸道黏膜屏障以及完整的免疫系統(tǒng)。肝硬化患者膽汁分泌減少[11]和門靜脈高壓[12]可影響腸道菌群的組成和生長，從而損害腸道屏障，增加腸道通透性，進而導致細菌移位、細菌代謝產物如脂多糖等堆積[13]，腸道菌群及其代謝產物穿過腸屏障后可通過門靜脈循環(huán)進入肝臟。肝Toll樣受體(TLR)是一類識別微生物結構保守分子的蛋白質[14]，也是脂多糖的受體，在肝臟Kupffer細胞、肝星狀細胞和肝細胞內表達。當肝臟持續(xù)暴露于腸道菌群代謝產物時，TLR作為脂多糖的靶細胞被激活，參與炎癥信號通路從而導致肝細胞反復受損、發(fā)生肝纖維化、肝硬化甚至HCC[15]。

表1 2組患者OTU及alpha多樣性參數(shù)比較

表3 2組患者綱至屬水平比較有意義的細菌平均占比情況(%)

在小鼠HCC模型中發(fā)現(xiàn)腸道菌群組成和數(shù)量的變化導致其代謝產物脫氧膽酸(deocycholic acid，DCA)增多。DCA是一種已知的DNA損傷物，這種損傷物和肥胖誘導的革蘭陽性菌成分磷脂壁酸協(xié)同作用，可誘發(fā)肝星狀細胞老化相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)，通過TLR2途徑上調SASP因子和環(huán)氧合酶2的表達，而環(huán)氧合酶2誘導的前列腺素E2通過前列腺素E型受體4抑制抗腫瘤免疫，從而導致HCC的發(fā)生[16]，DCA-SASP軸在HCC的發(fā)病機制中起重要作用[17]；也有研究[18]發(fā)現(xiàn)，小鼠體內膽酸蓄積，高水平膽酸的持續(xù)刺激導致肝臟發(fā)生慢性損傷和炎癥反應，在損傷修復過程中，或可出現(xiàn)肝臟異常增殖，最終導致HCC的發(fā)生；且在人類非酒精性脂肪肝相關性HCC的發(fā)生中也發(fā)現(xiàn)了類似的途徑[19]。此外，在小鼠HCC模型中，與普通小鼠相比，經過抗生素腸道除菌處理和在無菌條件下生長的小鼠腫瘤數(shù)量較少、體積較小[20-21]，表明殺滅腸道菌群的生長可抑制肥胖相關HCC，益生菌治療可減緩肝臟腫瘤生長[22]也支持這一理論。但腸道菌群對腫瘤發(fā)生起始階段的作用尚沒有確切結論。

本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者腸道菌群中放線菌門占比顯著低于肝硬化患者，其中以雙歧桿菌屬為代表，這也與之前的研究結論一致[22]。雙歧桿菌是人體腸道中的一組重要細菌，早在20世紀90年代就認為人體腸道中雙歧桿菌的減少或消失是“不健康”的[23]，現(xiàn)在認為雙歧桿菌可在多個方面促進人體健康，包括抑制有害菌生長從而維持腸道微生態(tài)平衡、促進消化、調節(jié)免疫功能、有助于防止感染等。此外，已有諸多證據顯示補充雙歧桿菌對慢性肝病患者有益[24-25]，而對肝硬化患者補充雙歧桿菌是否有預防HCC的作用尚待進一步研究。

既往針對擬桿菌門與HCC相關性的研究相對缺乏， Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，暴露于二甲基甲酰胺的大鼠模型腸道內理研菌科細菌豐度明顯偏高。二甲基甲酰胺有肝毒性，可導致肝臟炎癥、纖維化、肝硬化乃至于HCC的發(fā)生[27-28]。此外，Liu等[29]認為理研菌科可產生脂多糖。本研究發(fā)現(xiàn)HCC組腸道內理研菌科所占比例較肝硬化組明顯偏高(P<0.05)，但由于HCC的形成機制復雜且不十分明確，現(xiàn)無法確認理研菌科是否通過產生脂多糖或其他途徑參與HCC的發(fā)生，還需要進一步的研究與探索。

既往研究[30]表明，小鼠結腸膽汁酸水平與厚壁菌門中產生DCA的7α-脫羥基細菌呈正相關，后者指梭菌目細菌，主要包括Ruminococcaceae科和毛螺菌科[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，與肝硬化組相比，隸屬于梭菌目的Christenellaceae科細菌在HCC組腸道內相對豐度明顯偏高(P<0.05)，而Ruminococcaceae科細菌在HCC組腸道內占比也與肝硬化組不同(肝硬化組10.36% vs HCC組15.51%，P>0.05)，或可認為這些細菌通過產生脫氧膽酸導致HCC的發(fā)生，但未能發(fā)現(xiàn)2組患者膽汁酸水平有顯著差異，考慮可能與納入病例數(shù)較少有關。此外，本研究發(fā)現(xiàn)HCC組患者腸道內梭菌屬所占比例較肝硬化組明顯偏低(P<0.05)，該差異對肝硬化基礎上發(fā)生肝細胞癌的影響尚待進一步研究。

Islam等[30]發(fā)現(xiàn)小鼠結腸中膽汁酸濃度降低與腸桿菌科等病原菌過生長有關，既往也已明確大腸埃希氏菌(E.coli)增多與肝硬化患者發(fā)生HCC有關[22,32]。本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化組患者腸道內腸桿菌科某屬細菌所占比例與HCC組不同(2.52% vs 7.22%，P>0.05)，考慮主要原因是E.coli是隸屬于埃希氏菌屬的大腸桿菌種細菌，而本研究只分析到了屬水平的細菌。隸屬于變形菌門的其他細菌在肝硬化患者發(fā)生HCC的過程中是否起到與E.coli相似的作用，尚待進一步研究。

綜上所述，與單純肝硬化患者相比，肝硬化基礎上發(fā)生HCC者腸道菌群部分組成有顯著差異，但這些差異與肝硬化基礎上發(fā)生HCC之間相互作用的具體機制尚不明朗。另外，本研究納入病例數(shù)較少，還需要擴大例數(shù)、宏基因組學分析等進一步研究探索腸道菌群與肝硬化基礎上HCC發(fā)生的關系，為HCC的預防探索新的途徑。

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引證本文：ZHOU LX, HAN T, LIU BW, et al. A preliminary analysis of composition and structure of intestinal microbiota in patients with liver cirrhosis or hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(9): 1740-1744. (in Chinese) 周冷瀟， 韓濤， 劉保文， 等. 肝硬化及肝細胞癌患者腸道微生態(tài)組成和結構的初步分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(9): 1740-1744.

(本文編輯：王 瑩)

Apreliminaryanalysisofcompositionandstructureofintestinalmicrobiotainpatientswithlivercirrhosisorhepatocellularcarcinoma

ZHOULengxiao,HANTao,LIUBaowen,etal.

(TheThirdCentralClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300170,China)

ObjectiveTo investigate the differences in intestinal microbiota between patients with liver cirrhosis and those with hepatocellular carcinoma (HCC) complicated by liver cirrhosis, as well as the association between the change in intestinal microbiota and the development of HCC.MethodsA total of 35 patients with chronic liver diseases who were hospitalized in Department of Hepatology in Tianjin Third Central Hospital from December 2015 to May 2016 were enrolled, among whom 20 patients had liver cirrhosis (liver cirrhosis group) and 15 had HCC complicated by liver cirrhosis (HCC group). Fecal samples were collected from all patients, total bacterial DNA was extracted, and Roche 454 sequencing was used to determine the sequence of the V3-V6 viable regions of 16S rDNA. A bioinformatics analysis was also performed (species taxonomy, abundance analysis, and diversity analysis). Thet-test was used for comparison of continuous data between groups, and the Mann-WhitneyUtest was used for comparison of categorical data between groups.ResultsThe mean number of operational taxonomic units (OTUs) in the samples from the 20 liver cirrhosis patients was 306.50±163.76, and that in the samples from the 15 HCC patients was 357.24±168.85; there were no significant differences in the number of OTUs and alpha diversity between the two groups of patients (bothP>0.05). The bacteria in fecal samples included Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, and Proteobacteria. Genus-species and composition analyses showed that there was a significant difference in relative abundance of various bacteria in the intestine between the liver cirrhosis group and the HCC group, and compared with the HCC group, the liver cirrhosis group had significant increases in the proportions of Actinobacteria (0.21% vs 0.06%,U=89.000,P=0.043), Bifidobacterium (0.16% vs 0.04%,U=90.000,P=0.046), and Clostridium (0.13% vs 0.08%,U=90.000,P=0.046) and significant reductions in the proportions of Rikenellaceae (0.58% vs 2.30%,U=82.000,P=0.023) and Christenellaceae (0.01% vs 0.08%,U=84.500,P=0.028).ConclusionThere are significant differences in the composition of intestinal microbiota between patients with liver cirrhosis and those with HCC complicated by liver cirrhosis, while the specific mech anisms of the interaction between the differences and HCC with liver cirrhosis remained unclear.Keywords：liver cirrhosis； carcinoma, hepatocellular； enterobacteriaceae

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.09.022

2017-03-20；

2017-05-02。

國家科技重大專項(2016ZX10002008-07)；天津市科技計劃項目(13RCGFSY19200)

周冷瀟(1991-)，女，主要從事肝臟疾病的相關研究。

韓濤，電子信箱：hantaomd@126.com。

R575.2； R735.7

：A

：1001-5256(2017)09-1740-05