杜兵兵

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002)

纖維素酶輔助提取花椒揮發(fā)油工藝及其抗氧化作用的研究

杜兵兵

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002)

采用纖維素酶輔助提取花椒揮發(fā)油，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。分析各個(gè)因素的顯著性，得出纖維素酶輔助提取花椒揮發(fā)油的最佳工藝條件：纖維素酶的添加量為2%，預(yù)處理溫度為40 ℃，預(yù)處理時(shí)間為2 h，pH為4.6。在此條件下，花椒揮發(fā)油得率為11.58%。而且花椒揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，EC50為9.611 mg/mL。

花椒；揮發(fā)油；纖維素酶；提取工藝；抗氧化

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)為蕓香科植物，為藥食兩用芳香植物，很多文獻(xiàn)顯示：花椒中含有豐富的揮發(fā)油，具有調(diào)味、抗菌和殺蟲等功效[1]。目前關(guān)于花椒揮發(fā)油的提取主要側(cè)重水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2流體萃取法、超聲輔助溶劑萃取法和無溶劑微波蒸餾法[2,3]。而纖維素酶輔助提取揮發(fā)油為近幾年出現(xiàn)的提取方法，其中纖維素可以降解植物細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞活性成分有效溶出，提高提取率[4]。本研究利用纖維素酶酶解作用輔助提取花椒揮發(fā)油，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳工藝，并對(duì)揮發(fā)油抗氧化作用進(jìn)行研究，為花椒的開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒：采自河南省漯河市北舞渡鎮(zhèn)，經(jīng)鑒定為蕓香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥成熟果實(shí)；纖維素酶：寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，活力單位11000 U/g；石油醚、無水硫酸鈉等：均為分析純。

AB135-S型電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo 公司；98-1-B型電加熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型循環(huán)水式真空泵 鞏義市科學(xué)儀器有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋 金壇市宏華儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

將花椒粉末50 g置于100 mL燒瓶中。依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入適量纖維素酶液，在一定的pH、溫度條件下酶解預(yù)處理一定時(shí)間，然后按水蒸氣蒸餾法提取3 h，蒸餾液以石油醚萃取，萃取物加無水硫酸鈉靜置脫去水分，減壓旋蒸法去除石油醚，得花椒揮發(fā)油，稱重計(jì)算揮發(fā)油得率。揮發(fā)油得率(%)=揮發(fā)油重量/花椒重量×100%。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

設(shè)定酶的添加量為0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%、溫度為40 ℃，預(yù)處理2 h后參照1.2.1項(xiàng)進(jìn)行揮發(fā)油提取，并計(jì)算得率；設(shè)定酶的添加量為2%、溫度為30，40，50，60，70，80 ℃，預(yù)處理2 h后參照1.2.1項(xiàng)進(jìn)行揮發(fā)油提取，并計(jì)算得率；設(shè)定酶的添加量為2%、溫度為40 ℃、預(yù)處理時(shí)間為1，2，3，4，5，6 h，參照1.2.1項(xiàng)進(jìn)行揮發(fā)油提取，并計(jì)算得率；設(shè)定酶的添加量為2%、溫度為40 ℃、pH為4.1，4.6，5.1，5.6，6.1，6.6，預(yù)處理2 h后參照1.2.1項(xiàng)進(jìn)行揮發(fā)油提取，并計(jì)算得率。

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶添加量(1%，1.5%，2%)、酶解溫度(40，50，60 ℃)、時(shí)間(1，2，3 h)、酶解pH(4.1，4.6，5.1)，4個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，以揮發(fā)油得率為考察指標(biāo)。

1.2.4 花椒揮發(fā)油清除DPPH自由基活性測(cè)定

吸取0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL置于試管中，加入1 mL不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油的95%乙醇溶液1 mL，混合液在室溫下靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度A1，用同體積的95%乙醇溶液代替待測(cè)液，測(cè)定吸光度A2，同體積的95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液，測(cè)定吸光度A0，以VC作為對(duì)照，計(jì)算清除率，清除率(%)=[1-(A1-A0)/A2]×100%[5]。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶添加量對(duì)揮發(fā)油得率的影響

圖1 酶添加量對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由圖1可知，伴隨纖維素酶添加量的增加，揮發(fā)油得率不斷增大，但是當(dāng)纖維素酶添加量大于2%時(shí)，花椒揮發(fā)油的得率變化幅度降低，提示纖維素酶添加量達(dá)到2%時(shí)，底物與纖維素酶已經(jīng)結(jié)合，增加纖維素酶濃度，已沒有多余的底物與其結(jié)合，提取率不再改變。

2.1.2 預(yù)處理溫度對(duì)揮發(fā)油得率的影響

圖2 溫度對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由圖2可知，伴隨預(yù)處理溫度的增加，花椒揮發(fā)油的得率明顯增加，當(dāng)輔助提取溫度超過40 ℃時(shí)，揮發(fā)油的得率開始下降，可能是高溫降低了纖維素酶的活性。

2.1.3 預(yù)處理時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響

圖3 時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由圖3可知，伴隨時(shí)間的增加，花椒揮發(fā)油的得率明顯增加，當(dāng)預(yù)處理時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，揮發(fā)油的得率最高，然后延長(zhǎng)時(shí)間，得率變化幅度不明顯。

2.1.4 預(yù)處理pH對(duì)揮發(fā)油得率的影響

圖4 pH對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由圖4可知，隨著pH的增加，花椒揮發(fā)油的得率明顯上升，當(dāng)預(yù)處理pH達(dá)到4.6時(shí)，花椒揮發(fā)油的得率最高，然后伴隨pH的增加，得率明顯下降，可能與酶的最佳pH有關(guān)，過酸過堿均會(huì)影響酶的活性。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00。

由表1和表2可知，各因素對(duì)揮發(fā)油得率影響大小的順序?yàn)槊柑砑恿?溫度>pH>時(shí)間，其中酶添加量對(duì)花椒揮發(fā)油得率影響顯著。最佳酶輔助提取工藝組合為A3B1C2D2，即酶添加量為2%、預(yù)處理溫度為40 ℃、時(shí)間為2 h、pH為4.6。

2.3 不同預(yù)處理方法對(duì)花椒揮發(fā)油得率的比較

表3 不同預(yù)處理方法對(duì)花椒揮發(fā)油得率的比較

由表3可知，以纖維素酶輔助最佳提取工藝組合進(jìn)行預(yù)處理，花椒揮發(fā)油得率可達(dá)11.58%，高于溫水浸泡預(yù)處理法和直接蒸餾法。

2.4花椒揮發(fā)油清除DPPH自由基活性測(cè)定

圖5 清除DPPH自由基活性測(cè)定

由圖5可知，花椒揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除能力低于VC，其中VC對(duì)DPPH自由基的EC50為5.750 mg/mL，花椒揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的EC50為9.611 mg/mL。

3 討論

本試驗(yàn)應(yīng)用纖維素酶預(yù)處理法輔助提取花椒揮發(fā)油，并探討了花椒揮發(fā)油的抗氧化活性，結(jié)果表明：最佳輔助提取工藝為纖維素酶添加量2%、預(yù)處理溫度40 ℃、預(yù)處理時(shí)間2 h、pH 4.6，其中酶的添加量對(duì)花椒揮發(fā)油得率影響顯著。采用最佳預(yù)處理工藝路線，花椒揮發(fā)油得率為11.58%，明顯高于溫水浸泡預(yù)處理法和直接蒸餾法。而且花椒揮發(fā)油清除DPPH自由基活性測(cè)定也顯示花椒揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，EC50為9.611 mg/mL。

[1]韓勝男，李妍，張曉杭，等.花椒揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及抗腫瘤活性分析[J].食品科學(xué)，2014，35(18):13-16.

[2]楊瀟，芮光偉，蔣珍菊，等.三種不同方法提取花椒揮發(fā)油中化學(xué)成分的GC/MS/AMDIS比較分析[J].中國(guó)調(diào)味品，2014，39(5):118-121，133.

[3]孫可可，尹艷紅，邢曉曉，等.不同加工溫度和時(shí)間對(duì)超臨界花椒精油品質(zhì)的影響[J].中國(guó)調(diào)味品，2017，42(2):134-136，141.

[4]張辰露，張曉娟，朱雙全，等.Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取紫蘇葉揮發(fā)油工藝[J].中成藥，2016，38(9):2055-2059.

[5]張玲玲，張鵬，李士明，等.釀酒酵母檢驗(yàn)黑胡椒揮發(fā)油抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2016，37(23):51-56.

Study on Process of Cellulase Assisted Extraction of Volatile Oil fromZanthoxylumbungeanumMaxim. and Its Antioxidation Effect

DU Bing-bing

(Luohe Medical College, Luohe 462002, China)

Cellulase is used for assisted extraction of volatile oil fromZanthoxylumbungeanumMaxim. and orthogonal experiment is designed on the basis of single factor experiment. The optimum conditions are as follows: the additive amount of cellulase is 2%, the pretreatment temperature is 40 ℃, the pretreatment time is 2 h and the pH value is 4.6. Under such conditions, the yield of volatile oil is 11.58%, and the volatile oil ofZanthoxylumbungeanumMaxim. has certain scavenging ability to DPPH free radical, EC50is 9.611 mg/mL.

ZanthoxylumbungeanumMaxim.；volatile oil；cellulase；extraction process；antioxidation

2017-03-11

杜兵兵(1982-)，男，講師，在讀博士，主要從事應(yīng)用化學(xué)方面的研究。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.012

1000-9973(2017)09-0055-03