朱燕，趙潔，劉兵，符繼紅

(新疆大學(xué)理化測(cè)試中心，烏魯木齊 830046)

基于GC-MS結(jié)合偏最小二乘判別分析的薰衣草精油指紋圖譜研究

朱燕，趙潔，劉兵，符繼紅*

(新疆大學(xué)理化測(cè)試中心，烏魯木齊 830046)

建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)測(cè)定薰衣草精油的方法，分析了新疆法國(guó)藍(lán)和C-197(2)2個(gè)不同品種的21批薰衣草精油樣品，并基于該方法建立了薰衣草精油的指紋圖譜。以GC-MS結(jié)合保留指數(shù)對(duì)復(fù)雜未知物進(jìn)行定性分析，共確定了26個(gè)共有峰。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對(duì)訓(xùn)練集樣本進(jìn)行模式識(shí)別，根據(jù)模型的變量權(quán)重系數(shù)(VIP)篩選出了對(duì)品種的分類具有較大貢獻(xiàn)的潛在標(biāo)志物。并通過(guò)PLS-DA模型對(duì)7個(gè)未知樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，2個(gè)品種的薰衣草精油的均方根預(yù)測(cè)偏差(RMSPE)均為0.1323，模型對(duì)驗(yàn)證集中薰衣草樣本的判別準(zhǔn)確率為100%。結(jié)果表明：該方法精密度好，簡(jiǎn)單快速，為新疆薰衣草精油的品種鑒定與質(zhì)量評(píng)估提供了可靠的依據(jù)。

薰衣草精油；指紋圖譜；分類；偏最小二乘判別分析

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)，系唇形科薰衣草屬植物[1,2]。我國(guó)薰衣草的主要栽培地區(qū)是新疆的伊犁，是世界三大薰衣草基地之一[3]。薰衣草除了作為一種傳統(tǒng)中藥，還是一種重要的天然香料植物[4-6]。薰衣草精油香味濃郁而柔和，無(wú)毒副作用，作為食品添加劑，既可以使食品具有特殊風(fēng)味，又具有保健價(jià)值，被廣泛地應(yīng)用[7]。目前市場(chǎng)上由于不同品種混種、混收，加上人工法合成精油非常容易，導(dǎo)致以次充好的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，而應(yīng)用于食品的精油需要更嚴(yán)格的質(zhì)量保證。因此對(duì)薰衣草進(jìn)行系統(tǒng)的研究，建立薰衣草精油的質(zhì)量控制體系是非常必要的。薰衣草精油的化學(xué)成分極為復(fù)雜，不同品種薰衣草精油的化學(xué)成分和含量存在較大的差異。天然產(chǎn)物質(zhì)量控制是一項(xiàng)十分復(fù)雜的研究，中藥指紋圖譜技術(shù)目前已成為國(guó)際公認(rèn)的控制天然產(chǎn)物質(zhì)量的最有效手段[8-10]。指紋圖譜的特點(diǎn)是復(fù)雜、信息量極大，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以很好地解決指紋圖譜數(shù)據(jù)的復(fù)雜解析問(wèn)題。本文采用水蒸氣蒸餾法提取薰衣草精油，應(yīng)用GC-MS技術(shù)建立薰衣草精油的分析方法，并結(jié)合保留指數(shù)對(duì)薰衣草精油的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對(duì)新疆不同品種的薰衣草精油指紋圖譜進(jìn)行分析，從而為新疆薰衣草精油的品種判別和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Aglient 7890B GC-5977A MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；Sartorius BS124S AG電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；21批薰衣草樣品采集于新疆伊犁，分為法國(guó)藍(lán)(A1～A13)和C-197(2)(B14～B21)，樣品被分成訓(xùn)練集樣品(共14個(gè)，包括9個(gè)法國(guó)藍(lán)樣本A1～A9，5個(gè)C-197(2)樣本B1～B5)和驗(yàn)證集樣本(共7個(gè)，包括4個(gè)法國(guó)藍(lán)樣本A10～A13，3個(gè)C-197(2)樣本B6～B8)；正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品C5～C24上海試劑一廠；無(wú)水硫酸鈉(分析純) 天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薰衣草精油提取

準(zhǔn)確稱取30 g干燥的薰衣草花樣品，置于1 L圓底燒瓶中，加入420 mL蒸餾水，用揮發(fā)油提取器提取4 h，得到黃色透明、具有特殊濃郁氣味的精油，用無(wú)水硫酸鈉干燥后低溫密封保存。

1.2.2 GC-MS分析條件

色譜柱為HP-INNOWax毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.5 μm)；程序升溫：初始溫度50 ℃，以3 ℃/min升溫至200 ℃，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣(He)流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量0.4 μL；分流比30∶1。離子源溫度230 ℃；EI源電離能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍30～550 m/z。

1.2.3 保留指數(shù)的測(cè)定

取C5～C24正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品，采取與樣品相同的分析條件，測(cè)定正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。根據(jù)保留指數(shù)計(jì)算公式計(jì)算化合物的保留指數(shù)(RI)。通過(guò)譜庫(kù)檢索、化合物保留指數(shù)的計(jì)算值與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)在相同色譜柱HP-INNOWax上的RI文獻(xiàn)檢索值比對(duì)，對(duì)薰衣草精油組分進(jìn)行準(zhǔn)確定性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過(guò)EXCEL，SIMCA-P13.0軟件進(jìn)行處理計(jì)算。PLS-DA分析方法首先對(duì)分類變量和數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS分析，建立類別判別回歸模型，然后根據(jù)所建立模型計(jì)算驗(yàn)證集的分類變量(Yp)，當(dāng)Yp>0.5，且偏差<0.5時(shí)，判定屬于該類；當(dāng)Yp<0.5，且偏差<0.5時(shí)，判定不屬于該類；偏差≥0.5時(shí)，判別不穩(wěn)定。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一薰衣草精油樣品，在GC-MS色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次。以乙酸芳樟酯(14號(hào)峰)為參照峰，計(jì)算共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。結(jié)果表明：共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD小于3%，表明儀器的精密度良好。

1.2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批薰衣草樣品5份，按上述實(shí)驗(yàn)方法提取薰衣草精油，在GC-MS色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以乙酸芳樟酯(14號(hào)峰)為參照峰，計(jì)算共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。結(jié)果表明：共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD小于5%，表明方法的重復(fù)性良好。

1.2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一薰衣草精油樣品，在GC-MS色譜條件下分別在0，2，4，6，8，10，24 h進(jìn)樣測(cè)定。以乙酸芳樟酯(14號(hào)峰)為參照峰，計(jì)算共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。結(jié)果表明：共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD小于3%，表明薰衣草精油在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 薰衣草精油GC-MS指紋圖譜的建立

分別稱取21批薰衣草樣品，按2.1項(xiàng)下方法制得薰衣草精油，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，指紋圖譜色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 21批薰衣草精油GC-MS指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprint spectrum of 21 batches spectrum of lavender essential oils

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從21批薰衣草精油GC-MS指紋圖譜中共匹配出26個(gè)共有峰，且共有峰面積之和大于總峰面積的90%以上。將21批樣品色譜峰的響應(yīng)信號(hào)的平均值作為共有模式，建立薰衣草精油GC-MS的對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖2。

圖2 薰衣草精油GC-MS的對(duì)照指紋圖譜Fig.2 GC-MS reference fingerprint spectrum of lavender essential oils

其中，乙酸芳樟酯(14號(hào)峰)的色譜峰在色譜圖中較穩(wěn)定，峰面積較大，因此確定為參照峰，其余共有峰與乙酸芳樟酯的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值在0.159%～0.585%之間。對(duì)各批次樣品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度進(jìn)行計(jì)算。目前對(duì)中藥指紋圖譜相似度的計(jì)算方法有向量夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法。向量夾角余弦法是將指紋圖譜的相似度問(wèn)題轉(zhuǎn)換成多維空間中的兩個(gè)向量的相似性問(wèn)題，而相關(guān)系數(shù)法是對(duì)不同批次樣品的同種屬性進(jìn)行相似度比較[11]。本文以向量夾角余弦和相關(guān)系數(shù)法為測(cè)度，經(jīng)過(guò)計(jì)算21批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.904～0.990之間，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 21批薰衣草精油指紋圖譜的相似度Table 1 Similarities of fingerprint spectrum of 21 batches lavender essential oils

結(jié)果表明：21批薰衣草精油樣品的相似度均大于0.900，表明整體相似度良好。

2.2 共有峰的歸屬

由于精油復(fù)雜多變的化學(xué)成分，僅依靠質(zhì)譜的匹配度來(lái)確定相應(yīng)的化合物存在一定的不確定性。將樣品質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)合保留指數(shù)RI進(jìn)行驗(yàn)證，可極大提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)薰衣草精油指紋圖譜中的26個(gè)共有色譜峰進(jìn)行歸屬，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明：薰衣草精油的主要成分為芳樟醇(相對(duì)峰面積0.789～2.713)和乙酸芳樟酯(相對(duì)峰面積1)，是含量最高的2個(gè)化合物。同時(shí)，21批薰衣草精油中的26個(gè)共有特征峰的峰面積變化較大，表明不同樣品的薰衣草精油中化學(xué)成分的含量存在一定的差異。

表2 薰衣草指紋圖譜中的共有峰成分分析Table 2 Component analysis of common peaks in fingerprint spectrum of lavender essential oils

續(xù) 表

注：文獻(xiàn)值為HP-INNOWax色譜柱上的保留指數(shù)；“-”表示文獻(xiàn)未報(bào)道。

2.3 PLS-DA判別模型的建立與驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)以薰衣草樣品中26個(gè)共有化合物的相對(duì)面積的百分含量為X變量，以訓(xùn)練集樣品的品種類別為Y變量，按照法國(guó)藍(lán)和C-197(2)的實(shí)際品種類別，將Y變量人工分為2類，并對(duì)樣本進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA分析。法國(guó)藍(lán)和C-197(2)2個(gè)品種的PLS-DA的得分圖見(jiàn)圖3a，從圖中可以看出2個(gè)品種的薰衣草樣品明顯被分開(kāi)。其中R2Y=0.975，Q2=0.734，模型驗(yàn)證結(jié)果表明該模型穩(wěn)定，預(yù)測(cè)能力好，建模成功。變量權(quán)重系數(shù)(VIP)值可以量化由PLS-DA的每個(gè)變量對(duì)樣品分類的貢獻(xiàn)，VIP>1的變量被認(rèn)為是貢獻(xiàn)較大的變量。由PLS-DA的VIP得分圖3b中可以發(fā)現(xiàn)有8個(gè)變量的VIP值大于1，變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)依次為乙酸薰衣草酯>乙酸芳樟酯>β-檀香萜醇>桉油精>乙酸己酯>枯茗醛>莰烯>β-羅勒烯，而乙酸薰衣草酯和乙酸芳樟酯是對(duì)分類具有最大貢獻(xiàn)的2個(gè)化合物。

圖3 法國(guó)藍(lán)和C-197(2)樣品的PLS-DA得分圖(a)和VIP得分圖(b)Fig.3 PLS-DA score plot (a) and variable importance plot (b) of French blue and C-197(2) samples

利用PLS回歸分析方法對(duì)訓(xùn)練集樣本的26個(gè)共有化合物的相對(duì)面積百分含量與分類變量進(jìn)行回歸分析，并建立共有成分與分類變量的PLS回歸模型。所有訓(xùn)練集樣本法國(guó)藍(lán)和C-197(2)分類變量的PLS預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的回歸圖見(jiàn)圖4，圖中的直線為模型校正結(jié)果與實(shí)際分類間的回歸線，分類變量的實(shí)測(cè)值和模型的預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)為0.975，樣品辨別率為100%，說(shuō)明模型的擬合較好。

圖4 PLS-DA校正模型樣本分類變量的PLS預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的回歸圖Fig.4 Regression plot of reference and prediction category variables of sample by PLS-DA model

由圖4可知，模型將法國(guó)藍(lán)和C-197(2)樣本區(qū)分開(kāi)，即校正樣品分散在實(shí)測(cè)值等于1線上的法國(guó)藍(lán)品種樣品點(diǎn)和實(shí)際值等于0線上C-197(2)品種的樣本點(diǎn)能明顯分開(kāi)，結(jié)果表明PLS-DA模型具有很高的可靠性，可以用于檢驗(yàn)和判別新的樣品。

利用PLS-DA判別分析方法建立的薰衣草品種分類模型，對(duì)驗(yàn)證集中的7個(gè)未參加建模的樣本(4個(gè)法國(guó)藍(lán)樣本A10～A13，3個(gè)C-197(2)樣本B6～B8)進(jìn)行判別分析，法國(guó)藍(lán)樣本特征的預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。法國(guó)藍(lán)品種的薰衣草精油的均方根預(yù)測(cè)偏差(RMSPE)為0.1323，其中驗(yàn)證集中所有的法國(guó)藍(lán)樣本的分類變量(Yp)的預(yù)測(cè)值都接近于1，偏差在0.1左右；C-197(2)的分類變量的預(yù)測(cè)值基本為0，偏差均小于0.3。根據(jù)PLS-DA方法的判別準(zhǔn)則Yp>0.5且偏差<0.5可知，驗(yàn)證集所有的法國(guó)藍(lán)樣本均被正確識(shí)別，而C-197(2)樣本不具有法國(guó)藍(lán)樣本的特征，說(shuō)明PLS-DA判別模型對(duì)樣本的判別準(zhǔn)確率為100%。采用上述已建立的PLS-DA模型對(duì)C-197(2)樣本特征進(jìn)行預(yù)測(cè)，C-197(2)品種的薰衣草精油的均方根預(yù)測(cè)偏差(RMSPE)為0.1323，結(jié)果表明模型對(duì)驗(yàn)證集中的C-197(2)樣本的判別準(zhǔn)確率為100%。

圖5 驗(yàn)證集中薰衣草樣品的PLS-DA模型的判別結(jié)果Fig.5 Discriminant results of lavender sample in validation set by PLS-DA model

注：A表示法國(guó)藍(lán)，B表示C-197(2)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GC-MS法建立了薰衣草精油的指紋圖譜，該方法簡(jiǎn)單快速，精密度好，可用于薰衣草精油的指紋圖譜分析。采用GC-MS分析方法，對(duì)新疆薰衣草(法國(guó)藍(lán)和C-197(2))共21批精油樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，結(jié)合保留指數(shù)共確定了26個(gè)共有峰，樣品相似度均在0.900以上。采用PLS-DA對(duì)驗(yàn)證集中薰衣草樣品進(jìn)行模式識(shí)別，從中篩選出的 特征變量被確認(rèn)為潛在標(biāo)志物，可以作為薰衣草精油不同品種鑒定的標(biāo)志性化合物，通過(guò)PLS-DA模型對(duì)7個(gè)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，正確識(shí)別率為100%。因此該方法可以為新疆薰衣草精油的品種判別和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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Research on Fingerprint Spectrum of Lavender Essential Oil with Partial Least Squares Discriminant Analysis and GC-MS

ZHU Yan, ZHAO Jie, LIU Bing, FU Ji-hong*

(Center for Physical and Chemical Analysis, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Aim to establish a fingerprint analysis method of essential oil in lavender for quality control by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Twenty-one samples collected in Xinjiang which belong to two different lavender varieties of French blue and C-197(2) are analyzed by GC-MS. Identification of compounds is based on the retention indices and mass library. Twenty-six peaks are selected as the common peaks in fingerprint spectrum. Samples for training set are for pattern recognition by partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). Potential biomarkers screening is performed according to VIP value. Through the forecast of 7 unknown samples in the PLS-DA model, the root mean square prediction error of two kinds of lavender essential oil samples is 0.1323, the discrimination accuracy for the lavender varieties is 100% by PLS-DA model based on the validation set of samples. The results show that the established method could be rapid and accurate to evaluate the quality of lavender essential oil.

lavender essential oil；fingerprint spectrum；classification；partial least squares discriminant analysis

2017-03-15 *通訊作者

國(guó)家自然科學(xué)基金(21565024)；新疆大學(xué)博士科研究啟動(dòng)基金(BS120135)

朱燕(1993-)，女，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究；

符繼紅(1977-)，女，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及食品分析研究。

TS225.19

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.004

1000-9973(2017)09-0014-05