王盛林，趙震宇，劉平懷

(海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228)

10種熱帶富油微藻生物量、總脂含量及脂肪酸組成分析

王盛林，趙震宇，劉平懷

(海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228)

微藻生物柴油是當(dāng)前生物能源中最具發(fā)展?jié)摿Φ囊环N新型能源，為更好地開發(fā)微藻生物柴油，篩選出適合制備生物柴油的富油微藻，以10種熱帶富油微藻為研究對象，對其生物量、總脂含量及脂肪酸組成進(jìn)行分析。通過甲醇-氯仿(體積比為2∶1)稱量法測定10種熱帶富油微藻中的總脂含量，將從微藻提取的油脂經(jīng)過甲酯化反應(yīng)后,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析油脂中脂肪酸組成及含量。結(jié)果表明，10種熱帶富油微藻中ChlorellavulgarisCJ15和Desmodesmussp. WC08更適合制備生物柴油。

富油微藻；生物柴油；生物量；總脂含量；脂肪酸組成

隨著人們生活水平的提高，對能源的需求日益增加，發(fā)展可再生資源備受關(guān)注[1]。生物柴油的基本成分為脂肪酸甲酯，主要通過甘油三酯或游離脂肪酸與低等醇類反應(yīng)而得，是一種生物質(zhì)液體燃料，近年來已成為生物質(zhì)能源研究中的熱點(diǎn)[2-4]。早期大多以植物來源的油脂為原料生產(chǎn)生物柴油，其規(guī)模受到原料和成本的制約[5-6]。與其他產(chǎn)油作物相比，微藻具有繁殖速度快、生長周期短、不占用耕地且含油率高的特點(diǎn)，利用富油微藻作為生物柴油的原料可望顯著提高生物柴油的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，具有廣闊前景[7]。

熱帶富油微藻是一種單細(xì)胞光合自養(yǎng)植物，在自然界分布廣泛且種類和數(shù)量龐大，適應(yīng)性強(qiáng)，易于大規(guī)模培養(yǎng)且生長非常迅速[8]，油脂富含C16∶0、C18∶1、C18∶2和C18∶3[2]等脂肪酸，被認(rèn)為是制備液體燃料的良好原料。

本研究對10種熱帶富油微藻進(jìn)行管式培養(yǎng)，測定其生物量[9]。通過甲醇-氯仿(體積比2∶1)稱量法對10種微藻中的總脂含量進(jìn)行測定，將從微藻提取的油脂經(jīng)過甲酯化反應(yīng)后,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析藻油中脂肪酸組成及含量。篩選出適合制備生物柴油的富油微藻，為進(jìn)一步大規(guī)模培養(yǎng)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種

9種分離自海南熱帶自然水體的藻種：MicractiniumreisseriC67 (C67),ScenedesmusecornisG2 (G2),Coelostrumreticulata11B7 (11B7),ChlorellavulgarisCJ15 (CJ15),ChlorellasorokinianaXS04 (XS04),Chlorellasp.1A10 (1A10),Desmodesmussp.WC08 (WC08),Ankistrodesmussp.CJ02 (CJ02),MonoraphidiumdybowskiiC29(C29)；1種來自清華大學(xué)饋贈的藻種：ChlorellaprotothecoidesTH (TH)。其中海水藻包括：ChlorellavulgarisCJ15,Desmodesmussp. WC08和ChlorellasorokinianaXS04，其余藻種均為淡水藻。

1.1.2 試劑與儀器

BG11培養(yǎng)基，自制；海鹽、氯仿、NaCl、NaOH、濃硫酸，分析純；甲醇、正己烷，色譜純。所有試劑均購自國藥集團(tuán)。

管式光反應(yīng)器，TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析有限責(zé)任公司)，-40℃冰箱，TDL-5型離心機(jī)(常州中捷有限公司)，X0-5200DTD型超聲清洗儀(南京先歐有限公司)，HP6890/5973MSD型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國惠普公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)

微藻培養(yǎng)采用Zhao等[10]的方法，并進(jìn)行一定的修正。培養(yǎng)基采用BG11配方(見表1)，在管式光反應(yīng)器中加入去離子水，培養(yǎng)體積800 mL，所有培養(yǎng)基121℃滅菌30 min。將藻種按照10%接種量接種于管式光反應(yīng)器中。培養(yǎng)條件：室溫培養(yǎng)，光強(qiáng)8 000～10 000 lx，空氣流量0.5 L/min，海水藻添加海鹽量1.5 g/L。采用12 h光照12 h避光的方式培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，每天取樣，采用TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)測定藻液的A680，作生長曲線圖，通過擬合分析得出比生長速率，培養(yǎng)7 d后，將藻液8 000 r/min 離心2 min，收集藻泥，于-40℃冷凍，隨后將冷凍的藻泥置于冷凍干燥機(jī)中凍干，收集藻粉。生物量按下式計(jì)算：

生物量=藻粉質(zhì)量/培養(yǎng)液體積

表1 BG11培養(yǎng)基成分及含量

注：A5微量元素營養(yǎng)液組成為2.86 g H3BO3,1.18 g MnCl2·4H2O,0.222 g ZnSO4·7H2O,0.39 g NaMoO4·2H2O,0.079 g CuSO4·5H2O,0.049 4 g CO(NO3)2·6H2O,溶于1 L 蒸餾水中。

1.2.2 總脂含量測定

稱取藻粉約0.1 g(M)，加入氯仿-甲醇(體積比為2∶1)混合液3 mL，超聲提取15 min，然后離心分離，取上清液于潔凈試管中，再在含有藻粉的試管中繼續(xù)加入氯仿-甲醇(體積比為2∶1)混合液3 mL，重復(fù)之前的操作4～5次，最后合并上清液，并在含有上清液的試管中加入0.9%的NaCl溶液，靜置1 d待溶液分層，取下層液體于已稱質(zhì)量(m1)的西林瓶中，置于通風(fēng)櫥中待氯仿?lián)]干完全至恒重，稱量西林瓶和藻油的總質(zhì)量(m2),計(jì)算總脂含量(ω)。計(jì)算公式如下：

總脂產(chǎn)量=總脂含量×生物量

1.2.3 脂肪酸組成分析

取藻粉0.5 g，加入0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液5 mL，振蕩混合10 min后加入1%硫酸-甲醇溶液8 mL，振蕩混合10 min，再依次加入2 mL水和3 mL正己烷，離心收集上層溶液，重復(fù)萃取3～5次，合并上層溶液，待溶液揮發(fā)濃縮至1 mL左右用0.22 μm微孔濾膜過濾，置于氣相色譜樣品管中，封口待測。

用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定脂肪酸組成及其含量。色譜條件：氫火焰離子化檢測器(FID)；石英毛細(xì)管柱HP-FFAP(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；程序升溫從160℃開始，以6℃/min升到250℃，保持5 min；載氣為He；柱流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；分流比50∶1。質(zhì)譜條件：EI源；電離電壓70 eV；離子源溫度230℃；掃描范圍10～500 u；進(jìn)樣量1.0 μL。檢索質(zhì)譜圖庫，對藻油中脂肪酸進(jìn)行定性，定量分析采用對各組分峰面積積分，計(jì)算出脂肪酸各組分占脂肪酸總量的百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 10種熱帶富油微藻生長曲線、比生長速率及生物量

10種熱帶富油微藻生長曲線見圖1，比生長速率及生物量見表2。

圖1 10種熱帶富油微藻生長曲線

生長曲線反映了10種富油微藻的生長狀態(tài)和生長趨勢。圖1結(jié)果顯示，在接種后的2～4 d生長速率達(dá)到最大，進(jìn)入對數(shù)生長期，5 d后生長緩慢，進(jìn)入緩慢生長期。Desmodesmussp. WC08的A680在7 d內(nèi)一直高于其他富油微藻，有可能受其色素的影響比較大。

表2 10種熱帶富油微藻的比生長速率及生物量

由表2可以看出，10種富油微藻中除Ankistrodesmussp.CJ02外，其他富油微藻的生物量均在1.0～2.0 g/L之間，都適合高密度培養(yǎng)，而Desmodesmussp. WC08的生物量達(dá)(1.86±0.18)g/L，在10種富油微藻中更適合高密度培養(yǎng)。ChlorellaprotothecoidesTH在培養(yǎng)過程中有少量的貼壁現(xiàn)象，導(dǎo)致7 d 的A680有小幅度的降低。ChlorellavulgarisCJ15和Desmodesmussp. WC08的比生長速率分為(0.41±0.01)d-1和(0.40±0.01)d-1,兩者比生長速率相差0.01 d-1，其他富油微藻的比生長速率均在0.3～0.4 d-1之間。與其他富油微藻相比，ChlorellavulgarisCJ15和Desmodesmussp. WC08的生長和繁殖能力比較強(qiáng)。

2.2 10種熱帶富油微藻的總脂含量及總脂產(chǎn)量

圖2是10種熱帶富油微藻的總脂含量和總脂產(chǎn)量。

圖2 10種熱帶富油微藻總脂含量及總脂產(chǎn)量

圖2結(jié)果顯示，ChlorellavulgarisCJ15和ChlorellaprotothecoidesTH兩種微藻的總脂含量超過了35%，分別為(36.21±1.23)%和(35.18±1.31)%，Chlorellasp.1A10,Coelostrumreticulata11B7和Desmodesmussp. WC08的總脂含量在30%～35%之間，分別為(30.56±1.11)%，(31.77±1.22)%和(33.27±1.37)%，MicractiniumreisseriC67,ScenedesmusecornisG2,ChlorellasorokinianaXS04,MonoraphidiumdybowskiiC29和Ankistrodesmussp.CJ02的總脂含量在25%～30%之間。ChlorellavulgarisCJ15和Ankistrodesmussp.CJ02的總脂含量相差11.07個(gè)百分點(diǎn)，差距顯著。ChlorellavulgarisCJ15和Desmodesmussp. WC08的總脂產(chǎn)量相對較高且水平相當(dāng)，分別為(0.59±0.02)g/L和(0.62±0.02)g/L，Chlorellasp.1A10,Coelostrumreticulata11B7和ChlorellaprotothecoidesTH的總脂產(chǎn)量基本在同一水平，分別為(0.50±0.01)g/L、(0.49±0.03)g/L和(0.46±0.03)g/L，MicractiniumreisseriC67,ScenedesmusecornisG2和ChlorellasorokinianaXS04的總脂產(chǎn)量相差不大，分別為(0.35±0.02)g/L、(0.38±0.04)g/L和(0.34±0.01)g/L，Ankistrodesmussp. CJ02和MonoraphidiumdybowskiiC29的總脂產(chǎn)量在10種富油微藻中相對較低，分別為(0.25±0.01)g/L 和(0.28±0.03)g/L。從圖2中還可以看出，ChlorellaprotothecoidesTH的總脂含量相對較高，但是總脂產(chǎn)量卻不高，反而Desmodesmussp. WC08的總脂含量在10種富油微藻中不是最高，但是總脂產(chǎn)量相對較高，ChlorellavulgarisCJ15的總脂含量相對較高并且總脂產(chǎn)量與Desmodesmussp. WC08僅相差0.03 g/L，說明ChlorellavulgarisCJ15和Desmodesmussp. WC08均適合微藻油脂生產(chǎn)研究。

2.3 10種熱帶富油微藻的脂肪酸組成及含量

脂肪酸的組成是評價(jià)微藻油脂或生產(chǎn)微藻生物柴油時(shí)需要考慮的一個(gè)重要指標(biāo)[11-12]。表3是10種熱帶富油微藻的脂肪酸組成及含量。

表3 10種熱帶富油微藻脂肪酸組成及含量 %

注：-表示未檢出或含量很少。

由表3可以看出，每種熱帶富油微藻的脂肪酸組成都各有特點(diǎn)，所選的10種熱帶富油微藻中C16∶0、C18∶1(n-9)均高于其他脂肪酸含量，其中Desmodesmussp. WC08的C16∶0含量27.66%和C18∶1(n-9)含量39.86%。MicractiniumreisseriC67,Coelostrumreticulata11B7,ScenedesmusecornisG2,ChlorellasorokinianaXS04和MonoraphidiumdybowskiiC29這5種富油微藻含有較高的C18∶2(n-9)，分別為13.86%、12.46%、12.77%、15.36%和20.05%。ChlorellavulgarisCJ15,Chlorellasp. 1A10,ChlorellaprotothecoidesTH,Desmodesmussp. WC08和Ankistrodesmussp.CJ02含有較高的C18∶2(n-6)，達(dá)到14.25%、15.31%、13.15%、13.86%和14.28%。10種熱帶富油微藻中除Desmodesmussp. WC08外PUFA含量均在20%～30%之間，Desmodesmussp. WC08的PUFA含量為18.20%。一般單不飽和脂肪酸甲酯，特別是C18∶1比其他多不飽和脂肪酸甲酯更適合生物柴油的生產(chǎn)，因?yàn)楹休^多C18∶1的生物柴油能更好的平衡燃料的點(diǎn)火性、燃燒熱、冷濾點(diǎn)、抗氧化性、黏度和潤滑性等特性[13-14]。所以，脂肪酸中具有較高的C18∶1含量對生產(chǎn)生物柴油更為有利。由表3還可以看出，ChlorellavulgarisCJ15,Coelostrumreticulata11B7和Desmodesmussp. WC08的C18∶1(n-9)含量為37.72%、36.75%、39.86%，明顯高于其他富油微藻，含量超過35%，說明這3種藻均適合生產(chǎn)生物柴油。

3 結(jié) 論

研究通過對10種熱帶富油微藻進(jìn)行管式培養(yǎng)，檢測其生物量,根據(jù)生長曲線得出Desmodesmussp. WC08在10種富油微藻中更適合高密度培養(yǎng)且ChlorellavulgarisCJ15和Desmodesmussp. WC08的生長和繁殖能力強(qiáng)。利用甲醇-氯仿(體積比為2∶1)稱量法測定總脂含量，并采用GC-MS分析所得藻油的脂肪酸組成及含量，確定了ChorellavulgarisCJ15和Desmodesmussp. WC08均適合微藻油脂生產(chǎn)研究，由脂肪酸分析得出ChlorellavulgarisCJ15,Coelostrumreticulata11B7和Desmodesmussp. WC08均有生產(chǎn)生物柴油的潛力，初步分析得出ChlorellavulgarisCJ15和Desmodesmussp. WC08更適合擴(kuò)大培養(yǎng)和制備生物柴油，對于二者的產(chǎn)油代謝途徑以及優(yōu)化都有待進(jìn)一步研究，以期為微藻產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

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Biomass,totallipidcontentandfattyacidcompositionoftentropicaloil-richmicroalgae

WANG Shenglin, ZHAO Zhenyu,LIU Pinghuai

(Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, Ministry of Education, Department of Materials and Chemical Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China)

Currently, biodiesel has become one of the emerging energy which has the vast development potential. In order to develop the microalgae biodiesel and screen the potential biodiesel materials, biomass, total lipid content and fatty acid composition of ten tropical oil-rich microalgae were analyzed. The total lipid content was determined through methanol-chloroform (volume ratio 2∶1) gravimetric method. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used to analyze the fatty acid composition and content after methyl esterification reaction. The results showed thatChlorellavulgarisCJ15 andDesmodesmussp. WC08 were more suitable for biodiesel production among ten tropical oil-rich microalgae.

oil-rich microalgae; biodiesel; biomass; total lipid content; fatty acid composition

2016-11-11；

：2017-03-04

國家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(13C26244604892);海南省產(chǎn)學(xué)研一體化項(xiàng)目(CXY20150034);海南省中藥現(xiàn)代化科技專項(xiàng)(ZY201327);國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD14B01)

王盛林(1993)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⒃寮捌浯x產(chǎn)物開發(fā)(E-mail)1454379982@qq.com。

劉平懷，教授(E-mail)pinghuailiu@aliyun.com。

Q949;TQ642

：A

1003-7969(2017)08-0093-05

生物工程