楊志新，劉丁丁，屈敬陽，安 娜，許 倩，陳 龍(. 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000； . 華北理工大學(xué)，河北 唐山 06000； . 河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

【針灸研究】

針刺大鼠“相對(duì)穴”陽陵泉與陰陵泉對(duì)P物質(zhì)表達(dá)的影響研究?

楊志新1，劉丁丁2，屈敬陽3，安 娜3，許 倩1，陳 龍1
(1. 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000； 2. 華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000； 3. 河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的：觀察針刺大鼠相對(duì)穴陰陵泉與陽陵泉后穴區(qū)局部和血清中P物質(zhì)(SP)的表達(dá)，探討SP變化與“相對(duì)穴”協(xié)同增效的相關(guān)性。方法：除空白對(duì)照組外，其他各組大鼠給予電針干預(yù)后采用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前后大鼠血清中SP含量，穴區(qū)局部組織組化染色觀察穴區(qū)SP陽性表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，其他各針刺組穴區(qū)局部SP陽性表達(dá)和血清中含量均有不同程度的增多，其中針刺相對(duì)穴陽陵泉與陰陵泉穴組SP表達(dá)最為顯著，各針刺組比較，針刺旁開陽陵泉與陰陵泉穴組SP表達(dá)顯著低于其他各組。結(jié)論：針刺相對(duì)穴陽陵泉與陰陵泉穴SP穴區(qū)局部陽性表達(dá)和血清含量顯著增高，是相對(duì)穴配伍協(xié)同增效的可能因素之一。

相對(duì)穴；配穴；陽陵泉與陰陵泉；SP表達(dá)；針刺

P物質(zhì)(substance P，SP)是一種廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和其他周圍各組織器官的小分子神經(jīng)非阿片肽，參與多種生命活動(dòng)的調(diào)控，不僅參與免疫、生殖內(nèi)分泌等調(diào)節(jié)，還在痛覺傳遞、胃腸蠕動(dòng)、神經(jīng)保護(hù)、呼吸運(yùn)動(dòng)、血管擴(kuò)張、傷口愈合等方面起著舉足輕重的作用[1-2]，同時(shí)也是針刺效應(yīng)產(chǎn)生的關(guān)鍵啟動(dòng)因素之一[3]。相對(duì)穴[4-5]是指身體各部陰陽相對(duì)的2個(gè)腧穴，同時(shí)取用能發(fā)揮協(xié)同增效作用。陰陽互配，調(diào)節(jié)陰陽平衡，具有“從陰引陽，從陽引陰”之妙用[6]。前期研究表明，“相對(duì)穴”臨床應(yīng)用廣泛，療效肯定。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行針刺“相對(duì)穴”陽陵泉與陰陵泉，觀察電針刺激穴區(qū)后SP的局部部位表達(dá)及血清中的含量變化，初步探討與“相對(duì)穴”協(xié)同增效的相關(guān)性，為更進(jìn)一步深入研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Wsitar大鼠40只，體質(zhì)量230～240 g，雌雄不拘，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物處置全過程完全遵照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 藥品與試劑

小鼠源P物質(zhì)一抗(美國(guó)Abcom公司，貨號(hào)ab14184)，二步法免疫組化二抗試劑盒(北京中杉金橋公司，貨號(hào)ZLI-9018)，ELISA試劑盒(上海酶連生物科技有限公司，貨號(hào)ml003119)，華佗牌毫針(0.30 mm×40 mm，針柄20 mm，蘇州醫(yī)療器械用品有限公司生產(chǎn))。

1.3 儀器

DU800型紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Ckman Coulter公司)、2K15型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)、顯微鏡(日本Nikon公司)、電針治療儀G6805-Ⅱ型(青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司)

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

40只大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組(對(duì)照組)、針刺陽陵泉穴組(陽陵泉組)、針刺陰陵泉穴組(陰陵泉組)、針刺“相對(duì)穴”陽陵泉與陰陵泉穴組(陰-陽陵泉組)及針刺旁開陽陵泉與陰陵泉穴(旁陰-陽陵泉組)5組各8只。

對(duì)照組與其他各組以同樣的方法和時(shí)間固定，不給予其他任何刺激；針刺選穴根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]大鼠常用針灸穴位，選取相對(duì)穴陽陵泉與陰陵泉穴，旁開對(duì)照點(diǎn)選各穴左側(cè)旁開3 mm處[8]。采用電針法將大鼠固定，毫針針刺得氣后針柄接電針治療儀，刺激頻率2/15 Hz，強(qiáng)度1 mA，20 min；在實(shí)驗(yàn)開始后的第1、3、5、7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)共4次，每次干預(yù)結(jié)束后大鼠標(biāo)準(zhǔn)育成飼養(yǎng)過夜，最后1次干預(yù)完成后2 h取材。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血清中SP含量 取各組大鼠腹主動(dòng)脈血液并編號(hào)，分離血清采用酶聯(lián)免疫技術(shù)，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.2 穴區(qū)局部SP表達(dá) 采用組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)：取新鮮穴區(qū)局部組織(包括皮膚、皮下組織和少量肌肉組織，約1 cm×1 cm×0.4 cm)石蠟包埋、切片，采用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蒸餾水洗2次，PBS洗2次，熱修復(fù)抗原，然后浸入3%H2O2-甲醇，37 ℃溫箱孵育30 min以滅活內(nèi)源性酶。PBS洗3次后滴加正常山羊血清封閉液，37 ℃溫箱孵育30 min,甩去多余液體、不洗。滴加1∶200稀釋的一抗，4 ℃過夜，37 ℃溫箱復(fù)溫30 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗37℃30 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加辣根試劑，37℃30 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB避光顯色，蒸餾水終止顯色，蘇木素輕度復(fù)染。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠穴區(qū)局部SP表達(dá)的變化

圖1顯示，較深色區(qū)域?yàn)镾P陽性表達(dá)區(qū)域(箭頭所示)。顯微鏡下觀察其陽性表達(dá)程度為陰-陽陵泉組最為明顯，陽陵泉組、陰陵泉組次之，對(duì)照組、旁陰-陽陵泉組表達(dá)最少。

圖1 各組大鼠穴區(qū)局部SP陽性表達(dá)(×100,箭頭所示)

2.2 各組大鼠血清中SP含量比較

表1顯示，各組大鼠血清中SP含量依次為陰-陽陵泉組最多，陽陵泉組、陰陵泉組次之，對(duì)照組、旁陰-陽陵泉組最少。其中與對(duì)照組比較，其他各針刺組血清SP含量均有不同程度的增加。對(duì)照組與陽陵泉組、陰陵泉組、陰-陽陵泉組比較，各針刺組SP含量增多顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；對(duì)照組與旁陰-陽陵泉組比較，SP含量表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽陵泉與陰陵泉2組比較，血清SP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清中SP的含量

注：與對(duì)照組比較:*P<0.05；與陽陵泉組比較:#P<0.05；與陰陵泉組比較:△P<0.05；與陰-陽陵泉組比較:※P<0.05

3 討論

相對(duì)穴[6]作為一種新的配伍理論，陰陽或陰陽表里相配，在人體之根本即陰陽的調(diào)節(jié)方面起到“從陰引陽，從陽引陰”的作用。它是根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式、疾病譜的變化和臨床的需要，在傳統(tǒng)腧穴配伍和陰陽理論的指導(dǎo)下，依據(jù)經(jīng)脈循行規(guī)律、經(jīng)脈與腧穴的密切關(guān)系，提出的一種取穴少、療效好的配伍方式，其理論核心是“陰陽”。前期臨床研究表明，“相對(duì)穴”配穴廣泛，應(yīng)用于內(nèi)外婦兒各科疾病，特別是心血管、皮膚、五官、內(nèi)分泌、神經(jīng)等系統(tǒng)疾病，在臨床上均有很好的治療作用，往往能達(dá)到事半功倍、相得益彰的效果[9-11]。但其協(xié)同增效的作用機(jī)制尚不明確，本文系首次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。

SP[12]是發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽類激素之一，是一種傳遞信息、調(diào)節(jié)機(jī)體反應(yīng)的重要信使物質(zhì)，可被免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同識(shí)別進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和內(nèi)分泌功能。它主要存在于神經(jīng)纖維末梢部分，可以從初級(jí)神經(jīng)纖維傳入神經(jīng)纖維的中樞端向脊髓背角釋放，也可以從細(xì)纖維的外周端向皮膚釋放，中樞端SP參與到感覺信息傳遞過程中，外周端SP參與到傷害性保護(hù)反應(yīng)過程。前期研究表明，針刺時(shí)細(xì)神經(jīng)纖維受到刺激后可使末梢神經(jīng)中樞端和外周端同時(shí)釋放P物質(zhì)，發(fā)揮多種生理作用，產(chǎn)生針刺效應(yīng)[13]。大量研究已證實(shí)[14-16]，針刺可通過影響肥大細(xì)胞(Mast cell，MC)功能狀態(tài)，使MC聚集、脫顆粒釋放活性物質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮針刺效應(yīng)。也有實(shí)驗(yàn)表明[16-17]，針刺可作用于神經(jīng)末梢，可以刺激局部神經(jīng)末梢釋放SP，SP可激活組織中MC脫顆粒釋放生物活性介質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)MC又可以釋放SP作用于局部神經(jīng)末梢，二者協(xié)同增強(qiáng)針刺效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針刺可使穴區(qū)局部SP陽性表達(dá)增多，血清含量升高，且針刺“相對(duì)穴”陰陵泉與陽陵泉穴組遠(yuǎn)高于其他各組。這一結(jié)果表明，SP的陽性表達(dá)是相對(duì)穴配伍協(xié)同增效的可能因素之一，同時(shí)提示我們可以將SP的陽性表達(dá)變化作為量化針效的參考指標(biāo)之一，并為臨床判斷針效指標(biāo)選取提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足，只對(duì)穴區(qū)局部進(jìn)行組織取材檢測(cè)SP陽性表達(dá)，未涉及與其他部位之間的比較。本實(shí)驗(yàn)中穴區(qū)局部SP表達(dá)是采用形態(tài)學(xué)方法計(jì)量的，在圖像采集和處理方面主觀性強(qiáng)，可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，這些都需要我們進(jìn)一步探討和更深層次的研究。

[1] 陳波,李明月,趙雪,等. P物質(zhì)與針灸效應(yīng)的研究進(jìn)展[J]. 上海針灸雜志,2014,33(1):82-87.

[2] LAVIELLE S, CHASSAING G, PLOUX O, et al. Analysis of tachykinin binding site interactions using constrained analogues of tachykinins[J]. Biochem Pharmacol, 1988, 37(2):41-49.

[3] 康婧青,張賽,郭義,等. 穴位局部P物質(zhì)與肥大細(xì)胞在針刺效應(yīng)啟動(dòng)中作用的研究[J]. 上海針灸雜志,2014,33(11):1054-1058.

[4] 楊志新.相對(duì)穴及臨床應(yīng)用[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005.

[5] 王迎寒,楊志新,郭玉成,等.基于“相對(duì)穴”的針灸學(xué)教學(xué)內(nèi)容改革[J].中國(guó)針灸,2013,33(6): 557-559.

[6] 楊志新.“從陰引陽,從陽引陰”理論及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)針灸,2003,23(10):613-614.

[7] 余曙光, 郭義.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2009:156.

[8] 張迪,丁光宏,沈雪勇,等. 肥大細(xì)胞功能對(duì)針刺大鼠“足三里”鎮(zhèn)痛效應(yīng)的影響[J]. 針刺研究,2007,32(3):147-152.

[9] 何旭東,許建陽,劉靜,等.懸鐘透刺三陰交治療失眠癥60例[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2014,11(36):108-110.

[10] 楊志新,王繼東,王佩琛,等.針刺“相對(duì)穴”治療心房纖顫28例[J].中國(guó)臨床醫(yī)生,2012,40(1):57-58.

[11] 孟憲軍,楊蘭,周然宓.劉孔藤教授“內(nèi)關(guān)透外關(guān)”針刺法的臨證運(yùn)用[J].中國(guó)針灸,2013,33(7):640-644.

[12] 丁文躍,劉金輝. P物質(zhì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制,2016,32(8):893-895.

[13] 康婧青,郭義,張賽,等. P物質(zhì)與經(jīng)絡(luò)穴位相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 上海針灸雜志,2015,34(4):374-376.

[14] HEIB V, BECKER M, TAUBE C, et al. Advances in the understanding of mast cell function[J]. Br J Haematol, 2008, 142(5):683-694.

[15] WESOLOWSKI J, PAUMET F. The impact of bacterial infection on mast cell degranulation[J]. Immunol Res, 2011, 51(2-3):215-226.

[16] 周艷麗,東貴榮,李璐,等.針刺穴位信息啟動(dòng)傳導(dǎo)機(jī)制與肥大細(xì)胞的相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 上海中醫(yī)藥雜志,2016,50(3):98-101.

[17] SISMANOPOULOS N, DELIVANIS DA, ALYSANDRATOS KD, et al. Mast cells in allergic and inflammatory diseases[J]. Curr Pharm Des, 2012, 18(16):2261-2277.

[18] 薩喆燕,黃猛,張迪,等. 手針刺激“足三里”穴局部肥大細(xì)胞活動(dòng)與外周神經(jīng)放電的相關(guān)性研究[J]. 針刺研究,2013,38(2):118-122.

Effect of Acupuncture The Complementary Acupoints Yanglingquan and Yinlingquan on Substance P Expression

YANG Zhi-xin1, LIU Ding-ding2, QU Jing-yang3, AN Na3, XU Qian1, CHEN Long1
(1.ChengdeMedicalUniversity,HebeiChengde067000,China; 2.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,HebeiTangshan063000,China; 3.HebeiProvinceKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentforChineseMedicine,ChengdeMedicalUniversity,HebeiChengde067000,China)

Objective：To observe the expression of substance P in the point local and serum after acupuncture The Complementary Acupoints Yanglingquan and Yinlingquan in rats, so as to analyze the correlation with the change of substance P and the synergistic interaction of compatibility in Complementary Acupoints. Methods：40 SD rats were randomly and equally divided into 5 groups,8 rats each. Detecting the content of substance P in rats’ serum by ELISA technique and the expression of substance P in the point local by histochemistry method after electroacupuncture. Results：Compared with the group control, the positive expression of SP in the local area and the content of the serum in other groups were increased in different degrees. Compared with all of acupuncture groups, the SP expression was the least in the group of acupuncture the sideward of Yanglingquan and Yinlingquan. Conclusion：As compared with other groups, the positive expression of SP in the local area and the content of the serum were significantly increased.It is one of the possible factors for the synergistic interaction of compatibility in “Complementary Acupoints”.

Complementary Acupoints; Adjunct Points; Point Yanglingquan; Point Yinlingquan; SP expression; Acupuncture

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2014406047)-相對(duì)穴對(duì)MC趨經(jīng)穴募集及細(xì)胞間通訊的作用機(jī)制研究；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(ZD20131001)-相對(duì)穴協(xié)同增效的細(xì)胞和分子作用機(jī)制研究

楊志新，女(滿族)，河北人，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事相對(duì)穴臨床與作用機(jī)制研究。

R245.81

B

1006-3250(2017)08-1132-03

2017-02-23