王曉芳，梅楨，楊艾，楊莉萍

昆明衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院

彝藥雙參多糖的含量測(cè)定

王曉芳，梅楨，楊艾，楊莉萍

昆明衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院

目的研究彝族藥雙參中多糖含量的測(cè)定方法。方法以葡萄糖為對(duì)照，以苯酚-濃硫酸為顯色劑，采用分光光度法于波長(zhǎng)488nm處測(cè)定多糖含量。結(jié)果葡萄糖在20～120ug/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為A=0.0075c+0.0197,r=0.999 6,平均回收率為100.87%,RSD為2.15%（n=9）。測(cè)得雙參中多糖含量為25.82%～41.24%。結(jié)論表明雙參中多糖含量較高,具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

雙參；多糖；苯酚-濃硫酸比色法

雙參為川續(xù)斷科植物雙參Triplostegia glandulifera Wall.ex DC.的干燥塊根，又稱蘿卜參、對(duì)對(duì)參、童子參[1]。是一味彝醫(yī)的特色用藥,味苦，性溫，有益腎養(yǎng)肝，健脾寧心之功效，可用于肝腎虧虛，腰膝痠軟，頭暈乏力，不孕不育，月經(jīng)不調(diào)，心悸失眠等癥[1,2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，雙參具有明顯的抗應(yīng)激和降血糖的作用[3,4]。本實(shí)驗(yàn)用超聲提取法從雙參中提取多糖,采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定其含量。

1.儀器與試劑

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）；SK8200H超聲儀（上?？茘u超聲儀有限公司）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。雙參藥材經(jīng)昆明衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥劑教研室黃鷹老師鑒定；葡萄糖對(duì)照品（上海伯奧生物科技有限公司，編號(hào)A1262）；其它試劑均為分析純。

2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 雙參多糖的提取與精制稱取雙參粉末30g，置圓底燒瓶中，加石油醚（60～90℃）100ml，75℃超聲30min，脫脂，離心，揮干溶媒，藥渣加蒸餾水400ml，超聲提取20min，離心，減壓濃縮，濃縮液加乙醇使含醇量達(dá)80%，冰箱靜置過(guò)夜，離心，沉淀先后用乙醇、無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌，60℃烘干至恒重，即得精制雙參多糖[5]。精密稱取精制雙參多糖100mg，置100ml容量瓶中加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，從中取1ml于10ml容量瓶中定容至刻度，搖勻，即得0.1mg/ml精制雙參多糖溶液，備用。

2.1.2 5%苯酚溶液的配制取苯酚100g,加鋁片0.10g和碳酸氫鈉0.05g，蒸餾，收集182℃餾分。稱取精制苯酚10g，加水溶解，定容于200ml棕色容量瓶中（臨用前配制）。

2.1.3 對(duì)照品溶液的配制精密稱取葡萄糖對(duì)照品100mg，置100ml容量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，即得1mg/ml對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密取上述儲(chǔ)備液1ml于10ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得0.1mg/ml對(duì)照品溶液。

2.1.4 樣品溶液的制備樣品粉碎，過(guò)40目篩，精密稱取0.5g，置圓底燒瓶中，加蒸餾水20ml，超聲提取兩次，每次30min，離心，殘?jiān)盟礈欤?ml×3），合并上清液和洗液于100ml容量瓶中，定容，搖勻。精密移取上述液1ml于25ml容量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.2 測(cè)量波長(zhǎng)的選擇

精密吸取濃度為0.1mg/ml對(duì)照品溶液、精制雙參多糖溶液、蒸餾水各1ml于10ml具塞試管中，再各加5%的苯酚溶液1ml，搖勻，并迅速加入濃硫酸5ml，待冷卻后，沸水浴中加熱15min，迅速冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在200～600nm作全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果兩者在488～490nm范圍內(nèi)均有最大吸收，圖譜見(jiàn)圖1，所以確定最佳吸收波長(zhǎng)為488nm。

圖1 精制多糖與葡萄糖對(duì)照品光譜掃描曲線圖

圖2 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 換算因素的測(cè)定

精密移取0.1mg/ml精制雙參多糖溶液1ml，按“2.2.1”依法操作，測(cè)定A，用回歸方程計(jì)算多糖溶液中折合葡萄糖的濃度，利用公式f=W/（C×D）計(jì)算換算因素，得f=1.1687（n=3）。式中W為多糖的質(zhì)量（ug），C為多糖濃度（ug/ml），D為稀釋因素。樣品測(cè)定：精密移取樣品溶液1ml，按“2.2.1”項(xiàng)自“加5%的苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，測(cè)定A，用回歸方程計(jì)算樣品溶液中折合葡萄糖的濃度，按下式計(jì)算樣品中的多糖含量：

多糖含量（%）=C×D×f/W×100（1）

式（1）中,W為供試品的質(zhì)量（g）,C為供試品液中葡萄糖濃度（ug/ml），D為供試品的稀釋因素,f為換算因素。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取濃度為0.1mg/ml的對(duì)照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分置10ml具塞試管中，依次加蒸餾水補(bǔ)至2ml，按“2.2.1”依法操作，測(cè)定A。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（c）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖2），回歸方程為A=0.0075c+0.0197，r=0.999 6。結(jié)果表明，葡萄糖在20.0-120.0ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液1.0ml，按“2.2.1”依法操作，連續(xù)測(cè)定6次，吸光度值分別為0.448、0.448、0.448、0.447、0.446、0.445，得RSD為0.28%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液1.0ml，按“2.2.1”依法操作，顯色后于488nm處每隔10min測(cè)定一次吸光度值，連續(xù)測(cè)定1.5h，吸光度值分別為0.496、0.503、0.504、0.503、0.502、0.501、0.500、0.500、0.498，得RSD為0.52%，表明樣品溶液在1.5h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一樣品6份，按“2.1.4”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.2.1”依法操作，測(cè)定A，求得多糖的含量分別為：34.71%、36.80%、36.39%、36.96%、35.45%、36.45%，RSD為2.41%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

精密稱取已知含量的樣品（多糖含量36.13%）粉末9份，按高、中、低分別按下表精密加入葡萄糖對(duì)照品溶液，按“2.1.4”制備供試品溶液，按照“2.2.1”依法操作，測(cè)定A，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)確立的方法回收率較好。

2.9 樣品測(cè)定

取不同采摘地點(diǎn)的雙參藥材，按“2.1.4”項(xiàng)制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)自依法操作，測(cè)定A，計(jì)算樣品中多糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3.討論

超聲技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取[6],可以大幅度地提高有效成分的提取率，簡(jiǎn)化提取操作步驟，縮短提取時(shí)間，提高工作效率，節(jié)省溶劑。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，硫酸-苯酚溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并放入棕色瓶中避光保存。在測(cè)定多糖含量時(shí)，保持較高的硫酸濃度非常重要，因?yàn)樵擄@色反應(yīng)是以對(duì)多糖的水解和糠醛反應(yīng)為基礎(chǔ)，硫酸濃度低，會(huì)影響兩種反應(yīng)的進(jìn)行，由于樣品中苯酚的加入量會(huì)影響硫酸的濃度，故必須控制一個(gè)合適的比例。雙參中多糖的含量較高，達(dá)27%-40%，楚雄地區(qū)的雙參多糖含量明顯低于其他兩個(gè)地區(qū)，可能是由于該地區(qū)采購(gòu)的藥材為放置多年的陳藥所致。本文對(duì)雙參多糖含量進(jìn)行了測(cè)定，為雙參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

[1]楊本雷，余惠祥，等.中國(guó)彝族藥學(xué)[M].昆明：云南民族業(yè)版社，2004.198-199.

[2]李耕冬，賀廷超.彝醫(yī)植物藥[M].四川民出版社，1990.117-118.

[3]劉曉波，郭美仙，徐靜，等.雙參對(duì)小鼠抗應(yīng)激作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24（9）：1265-1266.

[4]劉曉波,郭美仙,李龍星.雙參降血糖作用的研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2008，29（5）：49-50.

[5]李娜，楊曉杰，李旭業(yè).植物多糖提取技術(shù)研究[J].高師理科學(xué)刊，2012，32（2）：86-89.

[6]韓勇.超聲波法提取茯苓菌絲體胞內(nèi)多糖的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,（6）：112-116

王曉芳（1986-），女，漢族，云南楚雄人，本科，助教，研究方向：藥理學(xué)教育；

梅楨（1985-），女，漢族，云南昆明人，本科，講師，研究方向：化學(xué)與藥學(xué)教育；

楊艾（1988-），女，漢族，云南宣威人，本科，助教，研究方向：藥理學(xué)教育。