劉玉梅 張自強 朱雪敏 位 蘭 石 珂 潘 麗

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽471023)

6-芐氨基嘌呤對大鼠小腸缺血再灌注損傷的影響

劉玉梅 張自強 朱雪敏 位 蘭 石 珂 潘 麗

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽471023)

本試驗旨在研究6-芐氨基嘌呤(6-BA)對大鼠小腸缺血再灌注(I/R)損傷的保護作用。選取80只雄性SD大鼠，隨機分為4組，即對照組、I/R模型組和低、高劑量6-BA組。低、高劑量6-BA組于術(shù)前3周分別連續(xù)灌胃10、20 mg/kg的6-BA，對照組和I/R模型組灌胃同體積的生理鹽水，每天1次。對照組在暴露腸系膜上動脈后不做阻斷；I/R模型組和低、高劑量6-BA組阻斷腸系膜血管30 min后再灌注60 min。隨后取大鼠空腸組織分別進行總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量檢測；采用單細胞凝膠電泳法檢測細胞DNA損傷程度，采用免疫組化法檢測半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase-3)表達情況。結(jié)果顯示，與I/R模型組相比，補充10、20 mg/kg的6-BA后，T-SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；小腸細胞DNA的拖尾現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，尾部DNA含量和拖尾率都顯著低于I/R模型組(P<0.05)；Caspase-3陽性表達細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。由此可見，10、20 mg/kg的6-BA能有效防護I/R對小腸的損傷，且20 mg/kg的6-BA作用效果尤為明顯。

6-芐氨基嘌呤；缺血再灌注；氧化損傷；凋亡

在眾多內(nèi)臟器官中，小腸對局部缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷最為敏感[1]。研究發(fā)現(xiàn)，小腸細胞極易受到局部缺血的影響，再灌注后會進一步導(dǎo)致黏膜受損[2]。在急性腸系膜缺血，出血性、外傷性、感染性休克或者嚴重?zé)齻约耙恍┦中g(shù)操作如小腸移植術(shù)、腹主動脈術(shù)等過程中常伴有I/R發(fā)生[3-4]。I/R不僅能夠?qū)е滦∧c本身的損傷，而且由于腸黏膜屏障的損壞也會引發(fā)全身性感染和多器官功能障礙[4-5]。由此小腸I/R損傷逐漸引起了研究者的關(guān)注。6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)是植物生長調(diào)節(jié)劑中細胞分裂素的一種，不僅被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)、果實生長及蔬菜保鮮等[6]，而且能夠有效防御植物組織的氧化應(yīng)激。另外，本課題組前期研究證實6-BA對小鼠腦和肝臟組織氧化損傷具有一定的保護作用[7-8]。在此基礎(chǔ)上，本試驗進一步從氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡相關(guān)蛋白表達等多角度考察6-BA對大鼠小腸I/R損傷的保護作用，以期為有效預(yù)防腸I/R損傷及動物飼料中抗氧化劑的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑

6-BA由美國Sanland公司生產(chǎn)，用0.06 mol/L的鹽酸配制成1 000、2 000 mg/L的儲備液；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性檢測試劑盒和考馬斯亮蘭試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。低熔點瓊脂糖購自美國Sigma公司；兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase-3)單克隆抗體購自美國Abcam公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2試驗動物

選取80只雄性SD大鼠，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。適應(yīng)環(huán)境7 d后，隨機分為4組，每組20只。對照組、I/R模型組和低、高劑量的6-BA保護組。6-BA保護組于術(shù)前3周分別連續(xù)灌胃給予10、20 mg/kg的6-BA，每天1次；對照組和I/R模型組灌胃同體積的生理鹽水灌胃。動物術(shù)前12 h禁食、不禁水。以3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定后取腹正中切口，對照組在開腹暴露腸系膜上動脈后不做阻斷；I/R模型組和6-BA保護組則用無創(chuàng)動脈夾阻斷其系膜血管30 min后再灌注60 min。結(jié)束后，立即剪取空腸組織樣品待用。

1.3儀器

生物組織切片機(RM-2235，德國Leica)、分光光度計(UV-6300，上海美譜達儀器有限公司)、熒光顯微鏡(BX41TF，日本Olympus)、電泳儀(DYY-11，北京六一儀器廠)、電泳槽(DYCP-33A，北京六一儀器廠)。

1.4T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量測定

制作10%小腸組織勻漿，用生理鹽水稀釋成1%組織勻漿液后參照試劑盒說明，用紫外/可見分光光度計在550 nm處比色，測定吸光度值，計算T-SOD活性。取10%小腸組織勻漿用生理鹽水稀釋成0.8%的勻漿液后，參照試劑盒說明，用紫外/可見分光光度計在412 nm處比色，測定吸光度值，計算GSH-Px活性。取10%小腸組織勻漿用生理鹽水稀釋成5%勻漿液后通過硫代巴比妥酸(TBA)法參照試劑盒說明，用紫外/可見分光光度計在532 nm處比色，測定吸光度值，計算MDA含量。

1.5單細胞凝膠電泳法檢測大鼠小腸細胞DNA損傷

制作小腸單細胞懸液，保存?zhèn)溆谩?0 ℃、0.75%的正常熔點的瓊脂糖溶液100 μL鋪于全磨砂載玻片上放入37 ℃烘箱過夜烘干后作為底層膠；再取上述瓊脂糖溶液110 μL加在底膠上，水平放于4 ℃冰箱中保存20 min至凝固作為第2層膠；吸取70 μL制備好的單細胞懸液和140 μL在37 ℃水浴中保溫的0.65%的低熔點瓊脂糖溶液混勻，吸取混勻液110 μL滴加在第2層膠上，水平放于4 ℃冰箱中保存20 min至凝固作為第3層膠。將制備好的膠板浸入細胞裂解液，4 ℃裂解1 h，然后置于電泳槽中加入電泳液，4 ℃解旋25 min，電泳20 min(20 V，200 mA)。電泳結(jié)束后加入中和液中和15 min，然后滴加10 mg/L的溴化乙錠(EB)溶液40 μL，染色10 min。在暗室中用熒光顯微鏡觀察并拍照。每組隨機選取3張膠片，每張在100倍下隨機選取8個視野，將彗星尾長>35 μm視為拖尾，采用CASP軟件測量各組細胞彗星尾部DNA含量、彗星尾長并統(tǒng)計拖尾率。

1.6免疫組化法檢測大鼠小腸凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達

采用免疫組化法檢測大鼠小腸組織切片中Caspase-3表達情況。參照免疫組化試劑盒，嚴格按照步驟進行。一抗4 ℃過夜，以磷酸鹽緩沖液做陰性對照。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥。光學(xué)顯微鏡下觀察到組織細胞中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性。

1.7統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果均以平均值±標準差表示，并采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間差異顯著性采用Duncan氏法進行檢驗，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.16-BA對大鼠小腸I/R損傷后T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

6-BA對大鼠小腸I/R損傷后T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響見表1，與對照組相比，I/R模型組大鼠小腸T-SOD、GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)，小腸MDA含量顯著升高(P<0.05)，證實I/R模型構(gòu)建成功。低、高劑量6-BA組大鼠小腸T-SOD和GSH-Px活性顯著高于I/R模型組(P<0.05)，小腸MDA含量顯著低于I/R模型組(P<0.05)。高劑量6-BA組小腸MDA含量與對照組間無顯著差異(P>0.05)。

2.26-BA對大鼠小腸I/R損傷后細胞DNA損傷的影響

大鼠小腸I/R損傷后細胞DNA損傷程度見圖1，對照組細胞核大小比較均一，為圓形熒光團，熒光強度均勻，邊緣光滑，未出現(xiàn)彗星狀拖尾；I/R模型組小腸細胞DNA損傷嚴重、彗星頭部較其他組變小，出現(xiàn)彗星狀尾巴；低、高劑量6-BA組小腸細胞DNA拖尾減輕，尾長減小。各組細胞尾部DNA含量和拖尾率見表2，與對照組相比，I/R模型組小腸細胞尾部DNA含量和拖尾率顯著升高(P<0.05)。與I/R模型組相比，低、高劑量6-BA組顯著降低尾部DNA含量和拖尾率(P<0.05)。

表1 6-BA對大鼠小腸I/R損傷后T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same column with difference letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

A:對照組 control group；B:I/R模型組 I/R model group；C:低劑量6-BA組 low dose 6-BA group；D:高劑量6-BA組 high dose 6-BA group。

圖16-BA對大鼠小腸I/R損傷后細胞DNA損傷的影響

Fig.1 Effects of 6-BA on cell DNA damage of small intestine of rats after I/R injury (200×)

2.36-BA對大鼠小腸I/R損傷后Caspase-3表達的影響

6-BA對大鼠小腸I/R損傷后Caspase-3表達的影響見圖2。與對照組相比，I/R模型組大鼠小腸I/R損傷后小腸Caspase-3陽性細胞數(shù)量明顯增多；而低、高劑量6-BA組小腸Caspase-3陽性細胞數(shù)量少于I/R模型組，證實6-BA改善了小腸I/R誘發(fā)的損傷。

3 討 論

當(dāng)組織器官血液供應(yīng)不足時，常導(dǎo)致細胞機能障礙甚至發(fā)生壞死，然而血流的迅速恢復(fù)會進一步加重器官的損傷程度，稱為I/R損傷。腸是機體內(nèi)細菌和內(nèi)毒素的最大儲存庫，當(dāng)I/R損傷引發(fā)腸屏障功能破壞后會引起一系列疾病的發(fā)生，如膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征、大量器官機能障礙(肝臟、肺臟、腎臟等)，因此腸被認為是引發(fā)機體器官系統(tǒng)異常的“馬達”[9]。盡管小腸I/R發(fā)生的詳細機制目前仍不明確，但是I/R能夠引發(fā)自由基形成、DNA損傷、線粒體膜電位去極化最終導(dǎo)致小腸細胞發(fā)生凋亡和壞死已得到了充分肯定[10]。半胱-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)又稱為死亡蛋白酶，是細胞凋亡中最重要的蛋白酶，它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征改變有關(guān)的蛋白，導(dǎo)致凋亡。其中，Caspase-3是參與凋亡的Caspase級聯(lián)反應(yīng)最終效應(yīng)子，是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[11]。因此，本試驗通過檢測小腸中抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量以及DNA損傷程度和Caspase-3蛋白表達來確定6-BA對小腸I/R損傷的預(yù)防作用。

表2 6-BA對大鼠小腸I/R損傷后細胞尾部DNA含量和拖尾率的影響

A:對照組 control group；B:I/R模型組 I/R model group；C:低劑量6-BA組 low dose 6-BA group；D:高劑量6-BA組 high dose 6-BA group。

圖26-BA對大鼠小腸I/R損傷后Caspase-3表達的影響

Fig.2 Effects of 6-BA on Caspase-3 expression of small intestine of rats after I/R injury (400×)

本試驗通過阻斷腸系膜血管30 min再灌注60 min構(gòu)建小腸I/R模型，發(fā)現(xiàn)其DNA損傷嚴重，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3陽性表達細胞數(shù)量顯著增加，證實了小腸對I/R的高度敏感性。再通過抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量的檢測，發(fā)現(xiàn)小腸I/R損傷與自由基有關(guān)。6-BA能夠抑制植物葉內(nèi)葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)的分解，保綠防老；能將氨基酸、生長素、無機鹽等向處理部位調(diào)運，具有穩(wěn)定、廉價和易于使用等特點，且是一種對人、畜安全的植物生長調(diào)節(jié)劑，因此廣泛用在農(nóng)業(yè)、果樹和園藝作物從發(fā)芽到收獲的各個階段。資料表明，許多植物生長調(diào)節(jié)劑不但能夠促進植物的生長而且還能預(yù)防動物組織的氧化損傷和抵抗衰老。如，6-糠氨基嘌呤能夠抑制動物肝臟[12]和卵巢[13]等組織器官的氧化應(yīng)激，甚至能夠提高衰老大鼠的免疫功能[14]。而6-BA化學(xué)結(jié)構(gòu)與6-糠氨基嘌呤十分相似，且其在植物方面的抗氧化損傷和抗衰老的作用非常顯著，是否6-BA也對動物組織具有抗氧化能力，目前未見報道。由此本實驗室前期通過給小鼠腹腔注射四氯化碳(CCl4)制作小鼠肝臟氧化損傷模型，并預(yù)先采用6-BA進行保護，結(jié)果證實6-BA能夠有效抑制CCl4誘發(fā)的小鼠肝臟抗氧化酶活性降低和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累[8]。鑒于腸I/R損傷與氧化應(yīng)激的關(guān)系，本試驗又進一步檢測了6-BA對小腸I/R損傷的保護作用。結(jié)果證實，6-BA能夠有效抑制大鼠I/R發(fā)生過程中出現(xiàn)的抗氧化酶活性降低、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積聚、DNA損傷和小腸細胞形態(tài)病變。這些結(jié)果提示，一定劑量的6-BA對大鼠小腸I/R損傷具有一定的保護作用。這為研發(fā)抗小腸I/R損傷的活性物質(zhì)提供了新思路，但詳細機制還有待于進一步探討。

4 結(jié) 論

① 10、20 mg/kg的6-BA可有效降低小腸I/R誘發(fā)的過氧化應(yīng)激損傷。

② 10、20 mg/kg的6-BA可有效降低小腸I/R誘發(fā)的細胞DNA損傷。

③ 10、20 mg/kg的6-BA可有效降低小腸I/R誘發(fā)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3陽性表達細胞數(shù)量的升高。

④ 10、20 mg/kg的6-BA能有效防護I/R對小腸的損傷，其中20 mg/kg的6-BA作用效果尤為明顯。

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Author, LIU Yumei, associate professor, E-mail: lymzq@126.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of 6-Benzylaminopurine on Ischemia/Reperfusion Injury of Small Intestine of Rats

LIU Yumei ZHANG Ziqiang ZHU Xuemin WEI Lan SHI Ke PAN Li

(College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

To explore the protective effects of 6-benzylaminopurine (6-BA) on ischemia/reperfusion (I/R) injury of small intestine of rats, eighty male SD rats were selected and randomly divided into four groups named control group, I/R model group, low and high dose 6-BA groups, respectively. Rats in low and high dose 6-BA groups were treated with 10, 20 mg/kg 6-BA by gavage once daily for 3 weeks, and rats in control group and I/R model group were treated with the same volume physiologic saline. Superior mesenteric artery of rats in control group was not blocked after exposed， while it was blocked in I/R model group and low and high dose 6-BA groups for 30 min, and then the blood vessel was reperfused for 60 min. Then the activities of total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px), and MDA content in jejunum tissue of rats were measured. Cell DNA damage was observed by single cell gel electrophoresis method, and the expression of cysteinyl aspartate specific proteinase 3 (Caspase-3) was determined by immunity histochemistry method. The results showed as follows: compared with I/R model group, the supplementation of 10 and 20 mg/kg 6-BA significantly increased the activities of T-SOD and GSH-Px (P<0.05), and significantly decreased MDA content (P<0.05); broom shaped tails were less, and DNA content of tails and percentage of broom shaped tails were significantly decreased (P<0.05); Caspase-3 positively expressed cell count was significantly decreased (P<0.05). These results reveal that 6-BA has protective effects against injury of I/R in small intestine, and the effect of 20 mg/kg 6-BA is better.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3153-3158]

6-benzylaminopurine; ischemia/reperfusion; oxidative damage; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.017

2017-03-13

國家自然科學(xué)基金(U1504325)

劉玉梅(1979—)，女，內(nèi)蒙古通遼人，副教授，博士，主要從事成體干細胞的定向分化機理和臨床應(yīng)用研究。E-mail： lymzq@126.com

S816

：A

：1006-267X(2017)09-3153-06