李敏 瞿杰 李夢婕 胡曉龍

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

Osa在果蠅卵巢生殖干細(xì)胞分化中的功能研究

李敏 瞿杰 李夢婕 胡曉龍

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

果蠅卵巢生殖干細(xì)胞（Germline stem cell，GSC）是在活體（in vivo）研究干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控的理想平臺。表觀遺傳機(jī)制在果蠅卵巢GSC命運(yùn)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其機(jī)理的探明需要研究并發(fā)現(xiàn)更多參與此過程的表觀調(diào)控因子。為探究果蠅染色質(zhì)重塑復(fù)合物BAP中特有的亞基Osa在果蠅卵巢GSC分化調(diào)控中的功能及其分子機(jī)理，利用GAL4/UAS二元表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合RNAi技術(shù)在干細(xì)胞微環(huán)境組分護(hù)衛(wèi)細(xì)胞（Escort cells，ECs）中特異性下調(diào)osa的表達(dá)，并通過免疫熒光染色法對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，敲減ECs中osa可致卵巢組織卵原區(qū)中未分化生殖細(xì)胞數(shù)目（Undifferentiated germ cells，UGCs）顯著增多，同時BMP信號通路激活標(biāo)志pMad、Dad-lacZ陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多，并觀察到EC細(xì)胞形態(tài)異常，不能有效包裹生殖系細(xì)胞。推論Osa以BMP信號通路依賴方式參與果蠅卵巢GSC的分化調(diào)控，其作用機(jī)理還可能涉及EC細(xì)胞特定的形態(tài)學(xué)過程。

果蠅；Osa；生殖干細(xì)胞；分化

成體干細(xì)胞是一類位于成體組織中的未分化細(xì)胞，具有自我更新（Self-renewal）能力與分化潛能，這兩方面的特性對于組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持及組織損傷后修復(fù)具有重要意義［1］。干細(xì)胞的增殖與分化之間的平衡受到細(xì)胞內(nèi)外部因素的共同精細(xì)調(diào)控［2］。增殖能力過強(qiáng)會引起干細(xì)胞積聚，甚至腫瘤發(fā)生。分化過度則會導(dǎo)致干細(xì)胞丟失，組織早衰。因此，研究干細(xì)胞自我更新與有序分化的調(diào)控機(jī)制對于機(jī)體組織的維持機(jī)理揭示以及癌癥治療、再生醫(yī)學(xué)方面的臨床應(yīng)用具有重要價值。果蠅卵巢作為實(shí)驗(yàn)材料易獲取，內(nèi)含的生殖干細(xì)胞具在體識別優(yōu)勢，是在體研究干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控機(jī)制的理想系統(tǒng)［3］。

果蠅卵巢的基本結(jié)構(gòu)單位為卵巢小體，卵巢小體前端的卵原區(qū)（Germarium）中含有2-3個生殖干細(xì)胞（GSCs）。在GSC周圍是由三類體細(xì)胞共同構(gòu)成的GSC微環(huán)境（Niche），它們分別是端絲細(xì)胞（Terminal filament，TF）、帽細(xì)胞（Cap cell，CpC）以及護(hù)衛(wèi)細(xì)胞。GSC不對稱分裂產(chǎn)生的一個子細(xì)胞保留干細(xì)胞命運(yùn)，另一個子細(xì)胞則遠(yuǎn)離微環(huán)境形成包囊母細(xì)胞（Cystoblast，CB）。CB經(jīng)4次連續(xù)的細(xì)胞分裂后形成16細(xì)胞包囊，其中一個細(xì)胞獲得卵母細(xì)胞的命運(yùn)。GSC的命運(yùn)受自身內(nèi)部機(jī)制與干細(xì)胞微環(huán)境共同調(diào)控［2］。BMP（Bone morphogenetic protein）信號是已知調(diào)控生殖干細(xì)胞自我更新與分化的最主要的微環(huán)境信號。微環(huán)境帽細(xì)胞能分泌信號分子Dpp，激活GSC中BMP信號通路，抑制分化促進(jìn)基因bam的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而維持GSC的未分化狀態(tài)［4-6］。微環(huán)境護(hù)衛(wèi)細(xì)胞位于生殖干細(xì)胞側(cè)方，其在GSC命運(yùn)調(diào)控過程中同樣扮演了重要角色［7］。研究顯示，護(hù)衛(wèi)細(xì)胞中的EGFR信號能抑制BMP信號的異位激活，促進(jìn)GSC的正常分化［8］。此外，護(hù)衛(wèi)細(xì)胞中一些因子如Lsd1、Rho信號等可通過抑制dpp的轉(zhuǎn)錄影響B(tài)MP信號激活［7，9］

SWI/SNF是一種進(jìn)化上相對保守的染色質(zhì)重塑復(fù)合物。在果蠅中，至少存在兩種不同的SWI/SNF類型的重塑復(fù)合物BAP和PBAP［10］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，果蠅SWI/SNF復(fù)合物共有的核心亞基Mor，Brm，Snr1是果蠅正常卵子發(fā)生過程所必需的［11-13］。那么其他非共有的亞基是否也參與了GSC的相應(yīng)發(fā)育過程呢？已知Osa是BAP形式復(fù)合物中的特有組分。本研究利用果蠅GAL4/UAS表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合RNAi技術(shù)，試圖探究Osa在果蠅卵巢生殖干細(xì)胞分化中的功能并分析其可能的作用機(jī)理，旨在為探明干細(xì)胞自我更新與分化的調(diào)控機(jī)理提供更多線索。

1 材料與方法

1.1 材料

采用的果蠅品系：c587-gal4、UAS-mCD8；；GFP、UAS-osa-RNAi-38285、UAS-osa-RNAi-35447以及作為陰性對照的UAS-mcherry-RNAi均購于Bloomington果蠅資源保藏庫。本研究中采用的實(shí)驗(yàn)試劑：熒光一抗 mouse anti-α-spectrin（1：20，DHSB）、rat anti-vasa（1：50，DHSB）、rabbit anti-vasa（1：200，Santa Cruz Biotech）、rabbit anti-GFP（1：1 000，Invitrogen）、rabbit anti-pMad（1：2 000，Edward Laufer）、rabbit anti-βgal（1：1 000，Cappel）；熒光二抗Alexa r488、Alexa m488、Alexa r546、Alexa m546均購于Molcular Probe公司，工作濃度均為1：1 000。PBS購于捷瑞生物工程有限公司；Triton-100購于BioRad公司；山羊血清購于GIBCO公司；多聚甲醛購于SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 果蠅遺傳操作 采用GAL4/UAS系統(tǒng)，c587-gal4品系分別與UAS-mcherry-RNAi、UAS-osa-RNAi-38285、UAS-osa-RNAi-35447品系果蠅雜交，并于25℃進(jìn)行2 h的卵收集。待培養(yǎng)至F1代果蠅羽化后，挑選所需的雌性果蠅置于29℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d后對其卵巢進(jìn)行解剖。具體步驟為：左手鑷固定成蟲，用右手鑷在果蠅尾部扯開一個小口，將腹部所含所有組織從小口中擠出，并從中挑出一對卵巢，完成解剖。

1.2.2 免疫熒光染色 將解剖好了的卵巢置于含1 mL 固定劑（4%多聚甲醛溶液）中固定30 min；用含0.3%Triton-x 100的PBS（PBST）洗滌3次；加入含1%Triton-x 100的PBS，將組織吹散后滲透1 h；滲透完成后，使用封閉液封閉2 h；繼而用含合適工作濃度的一抗4℃孵育過夜；第2天，用洗滌液洗滌4次，每次20 min；加入封閉液封閉1 h，之后使用二抗稀釋液室溫避光孵育2 h；孵育完成后加入DAPI至最終濃度為1：2 000，室溫染色10 min；最后用PBST避光洗滌4次，每次20 min，染色完成。1.2.3 果蠅卵巢組織制片及顯微觀察 在光學(xué)顯微鏡下，將染色完成后的果蠅卵巢組織移至九孔玻璃平板中，用較尖細(xì)的鑷子去除卵巢小體后端相對成熟的卵室，留下前端未成熟透明狀的卵原區(qū)，收集完成后用移液器吸至載玻片上，蓋玻片壓片后用指甲油封片。待指甲油完全干后即可顯微觀察。本研究在熒光顯微鏡（Nikon Eclipse 80i）下進(jìn)行熒光觀察，并利用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）采集熒光染色圖像。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 本研究使用GraphPad Prism6軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制圖，顯著性檢驗(yàn)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)護(hù)衛(wèi)細(xì)胞中osa的表達(dá)導(dǎo)致GSC分化受阻

為探究EC中Osa在源于GSC的生殖細(xì)胞譜系分化發(fā)育中的功能，使用c587-gal4驅(qū)動表達(dá)UAS-osa-RNAi轉(zhuǎn)基因，在果蠅卵巢組織卵原區(qū)EC細(xì)胞中特異性下調(diào)osa的表達(dá)，并通過免疫熒光染色標(biāo)識融合體，辨識該細(xì)胞器的形態(tài)特征，以判斷生殖細(xì)胞譜系的分化發(fā)育狀態(tài)。已知GSC和CB細(xì)胞中融合體呈球形，稱之為血影小體；在處于不同分化發(fā)育階段的2細(xì)胞期、4細(xì)胞期及8-16細(xì)胞期生殖細(xì)胞包囊中該細(xì)胞器分別呈棒狀、U形及分枝狀結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)分析顯示，與對照組相比，敲減EC中的osa可致卵原區(qū)中含球狀血影小體的生殖細(xì)胞（Undifferentiated germ cells，UGCs）數(shù)量顯著增多（圖1），表明源于GSC的生殖細(xì)胞譜系分化發(fā)育受阻。上述遺傳分析結(jié)果提示Osa以細(xì)胞非自治性方式參與果蠅卵巢中GSC的分化調(diào)控。

圖1 下調(diào)護(hù)衛(wèi)細(xì)胞中osa的表達(dá)影響GSC有序分化

2.2 在護(hù)衛(wèi)細(xì)胞中下調(diào)osa的表達(dá)影響B(tài)MP信號活性的分布

已知BMP信號活性精細(xì)調(diào)控果蠅卵巢中GSC的自我更新與分化。為探討Osa介導(dǎo)的GSC分化調(diào)控的分子機(jī)理，進(jìn)一步在敲減EC中osa的遺傳背景下，檢測BMP信號活性的分布有無異常。磷酸化Mad（pMad）是BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子Mad的激活形式，Dad-lacZ是BMP信號通路靶基因Dad的報(bào)告基因，磷酸化Mad（pMad）或Dad-lacZ的表達(dá)與否是評估BMP信號通路激活的分子標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)中，通過pMad或βgal抗體熒光染色來檢測BMP信號活性的分布。如圖2所示，對照組中pMad表達(dá)局限在果蠅卵巢組織卵原區(qū)最前端的2-3個GSC中，而實(shí)驗(yàn)組果蠅卵原區(qū)中pMad的表達(dá)范圍顯著擴(kuò)大，表現(xiàn)為卵原區(qū)前端pMad陽性生殖細(xì)胞數(shù)明顯增多，同時對實(shí)驗(yàn)組卵原中表達(dá)Dad-lacZ的生殖細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其較對照組也顯著增多。pMad及DadlacZ檢測結(jié)果均表明下調(diào)EC中osa的表達(dá)可致卵原區(qū)BMP信號過度激活，信號活性分布擴(kuò)張，進(jìn)而阻滯GSC的正常分化。

圖2 osa表達(dá)下調(diào)對BMP信號活性的影響

2.3 下調(diào)EC中osa的表達(dá)導(dǎo)致EC對生殖細(xì)胞的包裹缺陷

已有研究表明，EC細(xì)胞對生殖細(xì)胞的包裹缺陷與生殖細(xì)胞譜系分化發(fā)育受阻存在因果關(guān)聯(lián)。為驗(yàn)證這一細(xì)胞學(xué)機(jī)制是否同樣存在于Osa介導(dǎo)的GSC分化調(diào)控中，我們基于免疫熒光染色技術(shù)對osa表達(dá)下調(diào)的卵巢組織中的EC細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行評估。本實(shí)驗(yàn)利用報(bào)告基因mCD8-GFP勾勒EC的形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組卵原區(qū)中EC的形態(tài)發(fā)生改變，不能伸出偽足以包裹分化中的生殖細(xì)胞。這一結(jié)果初步證實(shí)，敲減果蠅卵巢組織EC中osa導(dǎo)致EC不能正常包裹生殖細(xì)胞。

3 討論

圖3 osa表達(dá)下調(diào)對EC細(xì)胞形態(tài)的影響

生殖干細(xì)胞不斷自我更新與分化以保障果蠅卵巢在整個生命周期中的生殖活力［1］。大量研究證明，干細(xì)胞自我更新與分化之間的協(xié)調(diào)受其自身內(nèi)部因素及源于微環(huán)境的外部機(jī)制在轉(zhuǎn)錄、翻譯等多種水平上共同調(diào)控，表觀遺傳調(diào)控作為一種重要的調(diào)控方式在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［14，15］。關(guān)于染色質(zhì)重塑復(fù)合物BAP中特有組分Osa在成蟲果蠅翅膀的形態(tài)建成以及神經(jīng)發(fā)育過程中的調(diào)控作用已有報(bào)道［16，17］。本研究運(yùn)用UAS/GAL4二元表達(dá)系統(tǒng)又對Osa在果蠅卵巢生殖干細(xì)胞GSC分化發(fā)育過程中的功能進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)特異性下調(diào)果蠅卵巢卵原區(qū)護(hù)衛(wèi)細(xì)胞中osa的表達(dá)可導(dǎo)致GSC分化受阻，提示osa以細(xì)胞非自治性方式在GSC的分化發(fā)育過程中發(fā)揮功能。進(jìn)一步研究顯示，BMP信號通路在實(shí)驗(yàn)組果蠅卵原區(qū)中過度激活，其活性分布范圍明顯擴(kuò)大。基于此我們推測，Osa調(diào)控GSC的分化過程可能依賴于BMP信號路徑。

已知EC是生殖干細(xì)胞的重要微環(huán)境細(xì)胞。正常情況下，EC能伸出細(xì)胞偽足以包裹生殖干細(xì)胞及其分化而來的子細(xì)胞。研究顯示，多個信號通路參與調(diào)控EC對生殖細(xì)胞的包裹行為。如EGFR（Epidermal growth factor receptor）信號通路配體加工激活所需的關(guān)鍵因子Stet或JAK/STAT信號通路核心轉(zhuǎn)錄因子Stat92E的功能喪失或表達(dá)下調(diào)均導(dǎo)致EC細(xì)胞形態(tài)異常及其對生殖細(xì)胞包裹缺陷［18，19］。2011年Kirilly等［7］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，護(hù)衛(wèi)細(xì)胞的包裹缺陷可引起生殖細(xì)胞分化受阻。EC動態(tài)的細(xì)胞偽足可能為分裂分化了的生殖細(xì)胞后移提供動力。本研究發(fā)現(xiàn)在護(hù)衛(wèi)細(xì)胞中下調(diào)osa的表達(dá)會導(dǎo)致護(hù)衛(wèi)細(xì)胞形態(tài)改變，使其不能形成細(xì)胞突起以包裹生殖細(xì)胞。因此，維持EC形態(tài)學(xué)特征可能是Osa調(diào)控GSC分化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。鑒于Osa是染色質(zhì)重塑復(fù)合物BAP的重要亞基，推論其作用于EC包裹生殖細(xì)胞的分子機(jī)理應(yīng)涉及對關(guān)鍵靶基因的表達(dá)調(diào)控，尤其是之前提及的多個信號通路的核心組分［18，19］。已有報(bào)道表明，在果蠅翅膀中，Osa是EGFR信號通路多種靶基因的正常表達(dá)所必需的［16］。因此，探究Osa通過調(diào)控EGFR信號活性在EC包裹生殖細(xì)胞過程中發(fā)揮作用這一可能分子機(jī)理將是我們未來的研究重點(diǎn)。

進(jìn)一步的研究還將利用ChIP-seq、高通量轉(zhuǎn)錄組測序及特定遺傳分析手段，從靶基因?qū)用娼沂綩sa調(diào)控生殖細(xì)胞分化的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

染色質(zhì)重塑復(fù)合物BAP中的特有組分Osa以非細(xì)胞自治性的方式作用于GSC的分化發(fā)育過程，其作用機(jī)理可能涉及BMP信號通路及EC細(xì)胞特定的形態(tài)學(xué)過程。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Function of Osa in the Differentiation of Drosophila Ovary Germline Stem Cell

LI Min QU Jie LI Meng-jie HU Xiao-long
（College of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240）

The Drosophila ovary germline stem cell（GSC）is recognized as an ideal model system for studying stem cell fate regulation in vivo. The epigenetic mechanism is involved in the Drosophila ovary GSC fate regulation. Identification and characterization of apparent epigenetic regulators involved in this process will contribute to reveal underlying regulatory mechanisms. The aim of this study is to investigate the possible functions and the molecular mechanisms of Osa，the chromatin remodeling complex BAP-specific subunit，in Drosophila GSC differentiation. GAL4/UAS binary system combined with RNAi technology was used to specifically down-regulate osa expression in escort cells（ECs），and immune fluorescent dyeing was for detecting the relevant indexes. The results showed that knock-down of osa led to a significant increase of undifferentiated germ cells（UGCs）in the germarium of ovarian tissue，the positive cells of pMad and Dad-lacZ，two BMP signaling activity reporters，increased significantly. Moreover，EC morphology was abnormal，and they failed to wrap germline cells. In conclusion，Osa might be involved in the regulation of GSC differentiation by BMP signaling pathway-depending and specific morphological process of ECs.

Drosophila；germline stem；GSC；differentiation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0289

2017-04-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471374）

李敏，女，碩士研究生，研究方向：果蠅卵巢生殖干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控；E-mail：807142998@qq.com

胡曉龍，男，博士研究生，研究方向：遺傳與發(fā)育生物學(xué)；E-mail：sw0401@qq.com