張志舟，張 飛，李勝男，陳秀敏，蔡群娣

(中國廣州分析測試中心 廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東 廣州 510070)

分析與測試

高效液相色譜法測定山茶油中麥角甾醇含量

張志舟，張 飛，李勝男，陳秀敏，蔡群娣

(中國廣州分析測試中心 廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東 廣州 510070)

以麥角甾醇為測定目標，建立測定山茶油中麥角甾醇的高效液相色譜法。樣品經(jīng)皂化提取后，采用高效液相色譜法進行測定。色譜條件為：C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相為純甲醇；流速1.0 mL/min；紫外檢測器：波長282 nm；進樣量20μL；外標法定量。結果表明：麥角甾醇線性回歸方程為Y=31.173X+0.3008(X為標物濃度，mg/L)，R2為0.99999，在0.50～10.0mg/L范圍內(nèi)線性良好，方法回收率為94.5%～102%，RSD為3.56%，檢出限為1.0 mg/kg。本方法測定茶油中麥角甾醇含量準確、重復性好、靈敏度高。

麥角甾醇；山茶油；高效液相色譜法

茶油又稱山茶油、茶籽油，是一種從油茶樹種子中獲得的，可以與橄欖油相媲美的高級植物油，經(jīng)過精煉之后的品質更佳[1]。茶油主要由油酸、亞油酸和少量的飽和脂肪酸組成[2]，不飽和脂肪酸含量高達90%以上[3]，茶油還富含角鯊烯、茶多酚、皂甙、脂溶性的維生素以及甾醇類物質[4]，其保健作用以及營養(yǎng)價值也十分突出，古代醫(yī)書《本草綱目》中記載，“茶籽，寒苦香毒，主治喘咳，去疾垢… …” ；據(jù)現(xiàn)代科學研究，茶油具有改善血液循環(huán)、降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化、預防肥胖、護肝解毒、消炎鎮(zhèn)痛等作用[5-7]。

麥角甾醇是一種廣泛存在于真菌類植物的植物甾醇類化合物[8]，是甾醇化合物的一種，為脂溶性維生素D2的前體[9]，其具有抗癌、防衰老、減毒等功能[10]。麥角甾醇作為真菌類的特征甾醇[11]，對于在真菌類植物中麥角甾醇的研究已經(jīng)非常深入[12-13]，但在茶油當中的研究以及報道還比較少，麥角甾醇通常以兩種形式存在[14], 即儲存在真菌細胞膜中的游離麥角甾醇和儲存在細胞液脂粒中的酯化麥角甾醇，關于游離態(tài)的測定的研究很多，而且方法也較為成熟，但對于酯化麥角甾醇的測定方法還鮮有報道，本實驗基于酯化麥角甾醇的性質，且存在于山茶油中的麥角甾醇均為酯化的形式，通過對油脂樣品進行皂化，建立山茶油中麥角甾醇含量的測定，為測定酯化態(tài)的麥角甾醇提供HPLC的測定方法。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀-紫外檢測器(DAD)(安捷倫科技(中國)有限公司)；FYC-500*8全自動旋轉萃取器(北京國環(huán)高科自動化科技研究院)；HH-6J數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋(金壇市城東盛聯(lián)實驗廠)；R-210旋轉蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI實驗室儀器公司)；BT125D電子天平(Sartorius)。

1.2 標準與試劑

麥角甾醇(≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer)；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(上海晶純生化科技股份有限公司，分析純)；焦性沒食子酸(廣東省化學試劑工程科技研究開發(fā)中心，分析純)；氫氧化鉀(廣州化學試劑廠，分析純)；甲醇(Honeywell色譜純)；無水乙醇(廣州化學試劑廠，分析純)；正己烷(廣州化學試劑廠，分析純)；三級水；無水硫酸鈉(廣州化學試劑廠，分析純)。

1.3 標準溶液配制

準確稱取麥角甾醇對照品0.01010 g于100.0 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，作為標準儲備液。

1.4 樣品前處理

樣品的提取與凈化：準確稱取樣品約2.0 g置于回流裝置的250 mL的磨口三角瓶中，加入0.2 g抗氧化劑BHT、1 g維生素C、1 g焦性沒食子酸以及40 mL無水乙醇混合均勻，再加10 mL 50%氫氧化鉀溶液，置于75℃攪拌水浴鍋中回流60min，皂化后立即放入冰水中冷卻。

將上述皂化后的溶液轉移至500 mL分液漏斗中，用30 mL的三級水分3次清洗三角瓶的殘留物，洗液一并倒入分液漏斗中，加入50 mL正己烷，分液漏斗置于全自動旋轉萃取器，震搖萃取5min，靜置分層，將下層水相溶液轉移到另一個分液漏斗中，再重復萃取兩次，合并上層正己烷，用三級水洗至中性。將洗至中性的正己烷過裝有適量無水硫酸鈉的濾紙，濾液裝在200 mL三角瓶內(nèi)，用少量正己烷洗滌無水硫酸鈉及濾紙合并于濾液。濾液在30℃旋轉蒸發(fā)至干，往三角瓶中準確加入5.0 mL甲醇，溶解殘留物，搖勻后，溶液過0.45μm濾頭，濾液供液相色譜測試。

1.5 色譜條件

色譜柱：安捷倫C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流速：1.0 mL/min；進樣量：20μL；柱溫30 ℃；檢測波長：波長282 nm，流動相：純甲醇。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

基于麥角甾醇的存在的兩種形態(tài)，麥角甾醇的提取主流的也有兩種方法，對于游離態(tài)的麥角甾醇，主要采取超聲波提取法；而對于以酯化形式存在的，一般采用皂化提取法[16],先把酯化的麥角甾醇經(jīng)氫氧化鉀溶液皂化變成游離態(tài)的麥角甾醇，本實驗加入無水乙醇，可以使油脂樣品與氫氧化鉀溶液進一步的混合在一起，使油脂分子與堿液之間的接觸面變大，加快了皂化的速率，從而減少外界光照、氧氣等因素對麥角甾醇的影響。直接超聲提取法是適用于游離態(tài)麥角甾醇的測定。皂化提取法則適用于油脂樣品或者存在形式是酯化態(tài)的樣品。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用高效液相色譜測定麥角甾醇時，主要有正相色譜法和反相高效液相色譜法；GB/T 25221-2010采用的就是正相色譜法，但正相色譜法使用的流動相一般都為正己烷、環(huán)己烷等烷烴類試劑，該類試劑毒性比較大，而且氣味很重，長期使用會是實驗人員出現(xiàn)頭暈、惡心等現(xiàn)象。在反相高效液相色譜流動相的選擇時，因麥角甾醇是維生素D2的前體，結構跟維生素D2較為相像，故參考了維生素D的測定時的流動相，選擇了甲醇：水=95:5以及純甲醇進行比較，得到結果為純甲醇作為流動相時，出峰時間較為合適，分離度能夠到達日常檢測需求，色譜峰對稱因子為0.89，塔板數(shù)為16890；故選擇純甲醇最終流動相。標準色譜圖以及樣品中色譜圖見圖1、圖2。

圖1 標準溶液的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution

圖2 山茶油樣品的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of camellia oil sample

2.3 線性范圍

用甲醇將麥角甾醇標準儲備液稀釋成濃度分別為0.50、1.00、2.50、5.00、10.0 mg/L，進行測定，以麥角甾醇標準系列濃度(X)為橫坐標，相應的色譜峰面積為縱坐標(Y)，得到的線性方程為Y=31.173X+0.3008，R2=0.99999，可知麥角甾醇在0.50～10.0 mg/L范圍內(nèi)，線性良好。

2.4 檢出限與定量限

麥角甾醇檢出限為1.0 mg/kg(信噪比S/N=3)；定量限為3.0 mg/kg(信噪比S/N=10)。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

選定濃度為5.0 mg/L的標準工作液，進樣量為20μL，連續(xù)進樣6次，求得相對標準偏差RSD為0.35%，系統(tǒng)精密度良好，對稱因子為0.89，塔板數(shù)為16890。

2.6 重復性實驗

取山茶油樣品6份，按照“1.4”進行樣品前處理，制得樣液，供液相色譜測定使用，求得相對標準偏差(RSD)為3.56 %，符合要求，方法重復性良好。

2.7 加標回收率

另取樣品6份，加入麥角甾醇標準儲備液，加標量為6.0 mg/kg。按照“1.4”進行處理，采用外標法定量，求得樣品加標回收率為94.5 %～102 %。方法的準確度較好，可滿足日常檢測要求。

3 結論

本方法建立了山茶油中麥角甾醇的反相高效液相色譜法。該方法適用于山茶油中麥角甾醇的測定，該方法系統(tǒng)適用性實驗滿足要求、線性良好、檢出限低、方法準確性高、靈敏、快速，可適用于山茶油中麥角甾醇的測定，也可為其它動植物油脂中麥角甾醇的檢測提供技術參考。

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(本文文獻格式：張志舟，張 飛，李勝男，等.高效液相色譜法測定山茶油中麥角甾醇含量[J].山東化工,2017,46(13):68-70.)

Determination of Ergosterol in Camellia Oil by High Performance Liquid Chromatography

ZhangZhizhou,ZhangFei,LiShengnan,ChenXiumin,CaiQundi

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals,China National Analytical Center(Guangzhou),Guangzhou 510070,China)

A new method for determination of ergosterol in camellia oil by reversed-phase high performance liquid chromatography.Peanuts were analyzed by high performance liquid chromatography after saponification with KOH- ethanol solution.The separation of ergosterol was conducted on a C18 column (4.6 mm×250 mm，5μm ) with the mobile phase of methanol.The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 282 nmand injection volume was 20μL. The egosterol was quantified by the external standard method.The linear regression equation was Y=31.173X+0.3008 with the range of 0.50～10.0mg/L.The correlation coefficients was 0.9999.The average recoveries of samples was in the range of 94.5%～102% and RSD was 3.56%. The determination of limit was1.0mg/kg. The results indicate that the method is accurate ,reliable and reproducibility in the analysis of camellia oil.

ergosterol;camellia oil;high-performance liquid chromatography(HPLC)

2017-05-02

廣東省科技計劃項目(2013B091604003)；廣東省科技計劃項目(2015B090906023)；廣東省科技計劃項目(2013B020501005)

張志舟(1988—)，男，廣東肇慶人，本科，助理工程師，主要從事食品、保健品、飼料安全檢測。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)13-0068-03