張志舟，蔡大川，鄭家概，張 飛，王和平，許澤群，丁少曼，陳 軼，蔡群娣，梁柳詠

(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

反相高效液相色譜法測(cè)定花生中的β-谷甾醇

張志舟，蔡大川，鄭家概，張 飛，王和平，許澤群，丁少曼，陳 軼，蔡群娣，梁柳詠

(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

建立了測(cè)定花生中β-谷甾醇的反相高效液相色譜法。樣品經(jīng)過(guò)氫氧化鉀—乙醇皂化提取后，采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。色譜條件為：C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈/異丙醇=50/50；流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器：波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10μL，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：β-谷甾醇在5.0～250 mg/L范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，方法回收率為90%～103%，RSD為3.74%，檢出限為3.0 mg/kg。本方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好、靈敏度高，可用于花生中β-谷甾醇的含量測(cè)定。

β-谷甾醇；花生；高效液相色譜法

花生作為一種主要油料作物，廣泛種植于溫帶和熱帶地區(qū)。我國(guó)花生產(chǎn)量居于世界第一，全國(guó)各地都可以種植，其中我國(guó)50%～60%的花生用于榨油[1]?；ㄉ薁I(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種功效成分，主要包括植物甾醇、天然維生素E、蛋白質(zhì)等，其中植物甾醇中β-谷甾醇含量最高[2]。

β-谷甾醇是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的一種類固醇化合物，廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞膜中[3]。研究表明：β-谷甾醇是一種重要的藥物原料，具有較為廣泛的藥理活性，它不僅可以降低膽固醇、抑制腫瘤、抗菌抗炎、調(diào)節(jié)免疫力等功效，還可以保養(yǎng)皮膚，延緩皮膚角質(zhì)化[4-9]。此外，β-谷甾醇還廣泛用于紡織柔軟劑、顏料分散劑和汽油乳化劑等方面。

目前，現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法主要采用氣相色譜法檢測(cè)β-谷甾醇，還沒(méi)有相關(guān)的液相色譜方法[10]。本實(shí)驗(yàn)參照β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)方法的前處理過(guò)程，建立了反相高效液相色譜法測(cè)定花生中的β-谷甾醇檢測(cè)方法，為篩選富含β-谷甾醇的花生品種提供方法支持，也為其它堅(jiān)果中β-谷甾醇的檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器(VWD)(安捷倫科技(中國(guó))有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI實(shí)驗(yàn)室儀器公司)；KQ-2200型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)； XFB-200高速中藥粉碎機(jī)(吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠)；BT125D電子天平(Sartorius)；UV-2450紫外分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)與試劑

β-谷甾醇(≥98.0%，北京中科質(zhì)檢生物科技有限公司)；氫氧化鉀(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)；乙腈(Honeywell色譜純)；異丙醇(天津市富語(yǔ)精細(xì)化工有限公司 色譜純)；無(wú)水乙醇(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)；正己烷(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)；去離子水；無(wú)水硫酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取β-谷甾醇對(duì)照品0.02553 g于50.0 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解定容，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.4 樣品前處理

將曬干后的花生樣品，去殼，用高速粉碎機(jī)粉碎。

樣品皂化：準(zhǔn)確稱取樣品約2.0 g于250 mL平底燒瓶中，加入30 mL無(wú)水乙醇混合均勻，再加10mL 50%氫氧化鉀溶液，置于80℃水浴鍋中皂化回流50min，皂化后立即放入冰水浴中冷卻。

樣品萃取：將上述溶液轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中，用60 mL的去離子水分3次清洗平底燒瓶的殘留物，洗液一并倒入分液漏斗中，加入50 mL正己烷，震搖萃取3min，靜置分層，將下層水相溶液轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)分液漏斗中，再重復(fù)萃取兩次，合并上層正己烷。用去離子水洗至中性。

過(guò)濾：將洗至中性的正己烷過(guò)裝有適量無(wú)水硫酸鈉的濾紙，濾液裝在200 mL三角瓶?jī)?nèi)，用少量正己烷洗滌無(wú)水硫酸鈉及濾紙合并于濾液。

濃縮定容：將濾液用氮?dú)庠?0℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入10 mL甲醇，在超聲波清洗器中輕搖超聲溶解殘留物，搖勻后，溶液過(guò)0.45μm濾頭，濾液供液相色譜上機(jī)測(cè)試。

1.5 色譜條件

色譜柱：月旭C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相：乙腈/異丙醇=50/50。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

目前，關(guān)于β-谷甾醇的前處理方法主要有皂化提取法、索氏提取法和超聲波提取法[11-12]。 如果樣品中β-谷甾醇的來(lái)源是人為添加的，則首選索氏提取法和超聲波提取法。皂化提取法適用于天然的、油脂含量較高的樣品。由于花生中蛋白質(zhì)、粗脂肪、硬油脂、脂肪酸的含量較高[13]，所以本實(shí)驗(yàn)選用皂化提取法?；ㄉ?jīng)過(guò)皂化提取后，不僅可以充分提取天然β-谷甾醇，而且還可以除去基質(zhì)中蛋白質(zhì)和脂肪酸的干擾。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm范圍內(nèi)對(duì)50 mg/L的β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，可知β-谷甾醇在紫外區(qū)最大吸收波長(zhǎng)為210 nm，因此選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

采用高效液相色譜測(cè)定β-谷甾醇時(shí)，常用流動(dòng)相體系主要有：乙腈-異丙醇，甲醇-水體系。由于甲醇在210 nm吸收較強(qiáng)，有較大的背景干擾，對(duì)基線影響較大，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-異丙醇體系。本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-異丙醇(70∶30)、乙腈-異丙醇(50∶50)和乙腈-異丙醇(30∶70)對(duì)β-谷甾醇分離的影響。結(jié)果表明流動(dòng)相為乙腈-異丙醇(50∶50)時(shí)，分離度能夠到達(dá)日常檢測(cè)需求，色譜峰形較好，出峰時(shí)間合適，作為最終流動(dòng)相。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖

Fig.1 Chromatogram of standard solution

2.3 花生中β-谷甾醇的測(cè)定

花生的前處理過(guò)程見(jiàn)“1.4”，制得樣品提取液，過(guò)濾上機(jī)測(cè)定，色譜條件同“1.5”，得到的樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 花生樣品的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of peanut sample

2.4 線性范圍

用無(wú)水乙醇將β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成濃度分別為5.0、10.0、50.0、100.0、250.0mg/L，進(jìn)行測(cè)定，以β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得到的線性方程為Y=21.844X-8.114，R2=0.9999，可知β-谷甾醇在5.0～250.0 mg/L范圍內(nèi)，線性良好。β-谷甾醇的檢出限為3.0 mg/kg(信噪比S/N=3)。

2.5 精密度試驗(yàn)

選定濃度為50 mg/L的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣量為10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.58%，儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量花生樣品6份，按照“1.4”進(jìn)行樣品前處理，進(jìn)行測(cè)定，求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.74 %，方法重復(fù)性良好。

2.7 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取樣品6份，加入β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加標(biāo)量為50 mg/100 g。按照“1.4”進(jìn)行處理，采用外標(biāo)法定量，求得樣品加標(biāo)回收率為90 %～103 %。方法的準(zhǔn)確度較好，可滿足測(cè)定要求。

3 結(jié)論

本研究建立了花生中β-谷甾醇的反相高效液相色譜測(cè)定方法。該方法適用于花生中β-谷甾醇的提取測(cè)定，方法準(zhǔn)確性良好，靈敏度高，可為篩選富含β-谷甾醇的花生品種提供方法支持，也可為其它堅(jiān)果中β-谷甾醇的檢測(cè)提供技術(shù)參考。

[1] 萬(wàn)書波.花生品質(zhì)學(xué)[M].2版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2007.

[2] 張建書,王 強(qiáng),劉紅芝,等.不同地區(qū)花生品種VE、植物甾醇組成與含量的分析比較[J]. 食品科學(xué),2012,33(22):191-195.[3] 袁金偉,王 帆,買文鵬,等.β-谷甾醇的結(jié)構(gòu)修飾研究進(jìn)展[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科 學(xué)版),2015,36(2):107-112.

[4] Li W H,Chang S T,Chang S C,et al.Isolation of antibacterial diterpenoids from Cryptomeria japonica bark[J]. Natural Product Research,2008,22(12):1085-1093.

[5] Choi J N, Choi Y H, Lee J M, et al. Anti-inflammatory effects of β-sitosterol-β-D-glucoside from Trachelospermum jasminoides (Apocynaceae) in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 murine macrophages[J]. Natural Product Research,2012,26(24):2340-2343.

[6] Liz R, Zanatta L, Dos Reis G O, et al. Acute effect of β-sitosterol on calcium uptake mediates anti-inflammatory effect in murine activated neutrophils[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2013, 65(1):115-122.

[7] Yuk J E, Woo J S, Yun C Y, et al. Effects of lactose-β-sitosterol and β-sitosterol on ovalbumin-induced lung inflammation in actively sensitized mice[J].International Immunopharmacology, 2007, 7(12):1517-1527.

[8] Li R, Jia C S, Yue L, et al. Lipase-catalyzed synthesis of conjugated linoleyl β-sitosterol and its cholesterol-lowering properties in mice[J].Journal of agricultural and food chemistry,2010, 58(3): 1898-1902.

[9] Rosenblat M, Volkova N, Aviram M. Pomegranate phytosterol (β-sitosterol) and polyphenolic antioxidant (punicalagin) addition to statin, significantly protected against macrophage foam cells formation[J]. Atherosclerosis, 2013, 226(1): 110-117.

[10] 全國(guó)糧油標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).GB/T 25223-2010 動(dòng)植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測(cè)定 氣相色譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[11] 王多嬌,周瑋顏,春榮徐,等. 油脂中膽固醇及植物甾醇組成及含量分析[J].中國(guó)油脂,2016,41(2)：106-109.

[12] 魏玉海,王慧春,劉亞蓉,等.藏藥材珠芽蓼中β-谷甾醇含量的超高液相色譜- 蒸發(fā)光散 射檢測(cè)法測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(2):495-497.

[13] 殷冬梅,張幸果,王 允,等.花生主要品質(zhì)性狀的主成分分析與綜合評(píng)價(jià)[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2011,12(4):507-512,518.

(本文文獻(xiàn)格式：張志舟，蔡大川，鄭家概，等.反相高效液相色譜法測(cè)定花生中的β-谷甾醇[J].山東化工,2017,46(5):80-82.)

Determination of β-sitosterol in Peanut by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromato Graphy

ZhangZhizhou,CaiDachuan,ZhengJiagai,ZhangFei,WangHeping,XuZequn,DingShaoman,ChenYi,CaiQundi,LiangLiuyong

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals, China National Analytical Center(Guangzhou),Guangzhou 510070,China)

A new method for determination of β-sitosterol in peanut by reversed-phase high performance liquid chromatography.Peanuts were analyzed by high performance liquid chromatography after saponification with KOH- ethanol solution.The separation of β-sitosterol was conducted on a C18column (4.6 mm×250 mm，5μm ) with the mobile phase of acetonitrile and isopropanol(50/50).The flow rate was 1.0 mL/min and injection volume was 10μL. The detection wavelength was 210 nm and quantified by the external standard method.The linearity were obtained in the range of 5.0～250 mg/L with correlation coefficients 0.9999.The average recoveries of samples was in the range of 90%-103% and RSD was 3.74%. The determination of limit was 3.0mg/kg. The results indicate that the method is accurate 、reliable and reproducibility in the analysis of peanut.

β-sitosterol;peanut;high-performance liquid chromatography (HPLC)

2016-01-12

張志舟(1988—)，男，廣東肇慶人，本科，助理工程師。

O657.7

A

1008-021X(2017)05-0080-03