劉春雨，劉 穎，王彥多，曹廣超，王集會

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 實驗中心，山東 濟(jì)南 250355)

發(fā)酵棕櫚仁粕活性物質(zhì)含量測定

劉春雨1，劉 穎1，王彥多1，曹廣超1，王集會2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 實驗中心，山東 濟(jì)南 250355)

對發(fā)酵棕櫚仁粕水溶性蛋白及醇沉小肽，寡糖的含量測定。通過水提及醇沉法對發(fā)酵棕櫚仁粕分別進(jìn)行活性物質(zhì)的提取，利用福林酚法對總蛋白及小肽進(jìn)行含量測定，利用改良苯酚-硫酸法對寡糖進(jìn)行含量測定。結(jié)果：通過對發(fā)酵棕櫚仁粕活性物質(zhì)含量測定，得出每克發(fā)酵棕櫚仁粕中水提總蛋白含量為19.1579 mg，80%醇沉提取得到的小肽含量為14.5102 mg，80%醇沉提取得到的寡糖的含量為175.5923 mg，50%醇沉提取得到的寡糖含量為286.5267 mg。利用福林酚法對發(fā)酵棕櫚仁粕水提及80%醇沉的總蛋白，小肽測定確定其具體含量；利用改良苯酚-硫酸法分別對50%，80%醇沉提取得到的寡糖含量測定，說明50%醇沉提取得到的寡糖含量要大于80%醇沉提取得到的寡糖含量。

發(fā)酵棕櫚仁粕；水提醇沉；含量測定；福林酚法；改良苯酚—硫酸法

棕櫚仁粕是棕油樹上的棕果(Elaeis Guineensis)經(jīng)機(jī)械榨取棕櫚油后的副產(chǎn)品。它是高質(zhì)量的家畜飼料，是適合大多數(shù)家畜的安全飼料，更可以替代谷物飼料。棕櫚作為一種優(yōu)良的飼料來源，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其中含有大量蛋白質(zhì)物質(zhì)，一些家畜必需氨基酸和豐富微量元素，而且棕櫚仁粕中總碳水化合物的含量高達(dá)50%，其中40%左右是以難以消化的非淀粉多糖形式存在；基于此性質(zhì)，本研究通過發(fā)酵技術(shù)對棕櫚仁粕進(jìn)行加工，研究表明發(fā)酵可將蛋白質(zhì)類物質(zhì)水解為小肽，更有利于家畜的消化吸收；也可將難消化的粗大纖維類物質(zhì)水解為可消化的寡糖類物質(zhì)，進(jìn)而提高了能量利用率[1-2]。本實驗對發(fā)酵棕櫚仁粕超聲水提及醇沉后采用福林酚法[3]，改良苯酚—硫酸法[4]對總蛋白、小肽及寡糖進(jìn)行含量的測定，為判斷家畜飼料能量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ—500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV9100B型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；ST 16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；HH—6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；SHB—III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FA1004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SK—1快速混勻漩渦器(中國深圳)；遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)。

1.2 試劑

牛血清蛋白(BSA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；堿性酮(酒石酸甲鈉、硫酸銅、碳酸鈉、氫氧化鈉均為分析純)；福林酚試劑(批號：HCRB110320，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；無水乙醇；甘露醇。

1.3 供試品

發(fā)酵棕櫚仁粕由濟(jì)南現(xiàn)代同茂飼料有限公司提供。

2 實驗方法

2.1 發(fā)酵棕櫚仁粕的制備

稱取適量棕櫚仁粕，將芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌按一定比例混合制作成菌液接種在棕櫚仁粕上，比例為1∶2。即50 kg原料加菌液20～25 kg，常溫下密閉發(fā)酵7天即可。

2.2 發(fā)酵棕櫚仁粕水提液的制備

精密稱取發(fā)酵棕櫚仁粕1.0000 g，按料液比1∶30加入蒸餾水，超聲20min，抽濾取殘渣再重復(fù)上述步驟2次。取3次上清液混合置于50mL容量瓶中用蒸餾水稀釋至刻度，即得發(fā)酵棕櫚水溶性提取物溶液。

2.3 50%、80%醇沉提取液的制備

分別向2.2下制備的發(fā)酵棕櫚仁粕水溶性提取物溶液中加入適量無水乙醇，使其乙醇濃度為50%、80%即得50%、80%醇沉提取液。

2.4 福林酚法測定總蛋白及醇沉小肽含量

2.4.1 供試品溶液制備

分別精密量取發(fā)酵棕櫚仁粕水提溶液及80%醇沉溶液2、6 mL于10 mL容量瓶中，分別加蒸餾水和80%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，置冰箱中備用。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白液的制備

精密稱取20.0000 mg牛血清蛋白置于100mL容量瓶中，加入蒸餾水稀釋至刻度即得200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。搖勻，置冰箱中備用。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量取牛血清蛋白液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置于試管中，加水至1 mL，加堿性銅5 mL，搖勻，室溫放置10 min，快速加入酚試劑0.5 mL，室溫放置30 min，于650 nm測定其吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白液質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=2.5598x+0.0103 相關(guān)系數(shù)r=0.9989。

2.4.4 供試品溶液的測定

精密量取2.4.1下的供試品溶液1 mL置于試管，加堿性銅5 mL，搖勻，按2.4.3方法測定其吸光度。發(fā)酵棕櫚仁粕水提溶液及80%醇沉溶液各平行測定三次。根據(jù)回歸方程計算發(fā)酵棕櫚仁粕水提溶液總蛋白及80%醇沉小肽含量。

2.5 改良苯酚—硫酸法測定總糖的含量

2.5.1 供試品溶液制備

分別精密移取發(fā)酵棕櫚仁粕水提液用50%、80%醇沉溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，分別50%、80%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，置冰箱中備用。

2.5.2 對照品溶液制備

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的甘露糖10.00 mg置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，即得0.1 mg/mL，搖勻，置冰箱中備用。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密量取甘露糖對照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度。再分別量取2 mL上述溶液于具塞試管中，精密加入50 g/L苯酚溶液1 mL，搖勻；迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻；室溫放置30 min后于490 nm測定吸光度。以各甘露糖的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，測得吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=1.4325x+0.0105，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。

2.5.4 樣品含量測定

精密量取2.5.1下供試品2 mL于具塞試管中，精密加入50 g/L苯酚溶液1 mL，搖勻；迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻；室溫放置30 min后于490 nm測定吸光度?？瞻讓φ辗謩e取2 mL 50%、80%乙醇溶液于具塞試管中，同法測其吸光度。50%、80%醇沉溶液各平行測定三次。根據(jù)回歸方程計算供試品中寡糖的含量，見表1；其RSD見表2。

表1 50%、80%醇沉發(fā)酵棕櫚仁粕水提液寡糖含量對比(x±s mg/g)Table 1 sank by 50%, 80% alcohol fermentation palm kernel meal oligosaccharide content in liquid water extraction(x±s mg/g)

表2 50%、80%醇沉發(fā)酵棕櫚仁粕水提液寡糖RSDTable 2 sank by 50%, 80% alcohol fermentation palm kernel meal oligosaccharide RSD in liquid water extraction

注：RSD≤5%。

3 結(jié)果與分析

此實驗通過福林酚法測定每克發(fā)酵棕櫚仁粕水提液中總蛋白含量為19.1579 mg，用80%乙醇沉淀后測得的小肽含量為14.5102 mg，小肽含量占總蛋白含量的75.74%，說明發(fā)酵后的棕櫚仁粕蛋白質(zhì)類物質(zhì)多以小肽形式存在。表2中50%、80%醇沉發(fā)酵棕櫚仁粕水提液寡糖RSD數(shù)值均小于5%，說明測定的數(shù)值精密度良好；由表1可以看出用50%乙醇沉淀后所測得的寡糖含量比80%醇沉的含量增大，說明用50%乙醇沉淀可以得到更多的寡糖物質(zhì)。

4 討論

(1)通過對棕櫚仁粕進(jìn)行發(fā)酵可以將大蛋白降解為小分子小肽類物質(zhì)，將難消化的粗大纖維類物質(zhì)水解為可消化的寡糖類物質(zhì)，進(jìn)而提高了能量利用率，作為飼料而言，可以增加其營養(yǎng)性，功能性和適口性，更有利于家畜的吸收和利用[5]。由實驗結(jié)果看出小肽含量占到總蛋白的75.74%，由此推斷發(fā)酵可使棕櫚仁粕中的總蛋白部分可以轉(zhuǎn)化為能夠很好吸收的多肽類物質(zhì)；通過醇沉可以得到較多的寡糖物質(zhì)。

(2)寡糖又稱低聚糖是少數(shù)單糖(2～10個)縮合的聚合物，可通過多糖水解得到。在前人總結(jié)中可看出寡糖可以促進(jìn)腸道有益菌繁殖，調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，保持腸道正常生理功能、抗氧化、提高動物體液和細(xì)胞免疫、促進(jìn)消化吸收等優(yōu)點[6]，本研究通過發(fā)酵及水提醇沉法得到大量的寡糖物質(zhì)尤其在50%乙醇下沉淀會得到較80%乙醇沉淀更多寡糖物質(zhì)，為今后對寡糖在棕櫚仁粕飼料的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

(3)醇沉工藝的原理是提取物既溶于水又溶于乙醇，用適量濃度乙醇沉降可有效的除去粘液質(zhì)、糊化淀粉、果膠等雜質(zhì)。通常當(dāng)乙醇濃度為50%～60%時可除去淀粉等雜質(zhì)；75%時可除去蛋白質(zhì)類物質(zhì)；80%時幾乎可以將全部的蛋白質(zhì)除去。因此本文選用80%乙醇進(jìn)行降沉測定多肽含量，用50%和80%乙醇降沉進(jìn)行寡糖含量的對比。

[1] 唐茂妍,陳旭東,和小明.棕櫚仁粕在動物飼料中的應(yīng)用研究[J].飼料工業(yè),2013,34(20):45-48.

[2] 殷臘生,張麒麟,陳正望.固體發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料的研制[J].飼料與畜牧,2010(7):43-46.

[3] 劉春雨,劉玉慧,李曉輝,等.蜈蚣粉發(fā)酵前后水溶性物質(zhì)含量對比研究[J].湖南中醫(yī)雜志,2016，32(11)：167-169.

[4] 董 群,鄭麗伊,方積年.改良的苯酚硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究[J].中國藥學(xué)雜志,1996,31(9):550-553.

[5] 殷臘生,趙初輝,李 晶,等.固體發(fā)酵法生產(chǎn)棕櫚仁粕多肽飼料的研制[J].飼料與畜牧,2009(10):26-28.

[6] 李亞學(xué),周巖民.寡糖在飼料中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].獸藥與飼料添加劑,2009,14(6):18-21.

(本文文獻(xiàn)格式：劉春雨，劉 穎，王彥多，等.發(fā)酵棕櫚仁粕活性物質(zhì)含量測定[J].山東化工,2017,46(5):78-79,82.)

Determination of the Content of Active Substances in Fermented Palm Kernel Meal

LiuChunyu1,LiuYing1,WangYanduo1,CaoGuangchao1,WangJihui2*

(1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;2. The Experiment Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China)

Determining the contents of water-soluble protein and polypeptide, and ethyl alcohol deposition in fermented palm kernel meal. Methods: By using the water to mention alcohol sink fermented palm kernel meal for the extraction of active substance respectively, using the foline-phenol method for content determination of total protein and polypeptide, using modified phenol - sulfuric acid method for content determination of sugars. Results: Through determining the fermented palm kernel meal content of active substances, it is concluded that water in the fermented palm kernel meal per gram total protein content was 19.1579 mg, sank 80% alcohol extract of the peptide content was 14.5102 mg, sank 80% alcohol extract of the content of oligosaccharides was 175.5923 mg, sank 50% alcohol extract of oligosaccharide content was 286.5267 mg. Conclusion: Foline-phenol method was used to ferment palm kernel meal water to mention 80% alcohol and total protein, polypeptide measurement to determine the specific content; For 50% respectively using modified phenol - sulfuric acid method, sank 80% alcohol extract of oligosaccharide content determination, that sank 50% alcohol extract of oligosaccharide content more than 80% alcohol sink extract content of oligosaccharid

fermented palm kernel meal;water extraction and alcohol precipitation;content determination; foline-phenol method;modified phenol sulfuric acid method

2017-02-07

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計劃資助項目(編號：2016032)

劉春雨(1995—)，女，山東濟(jì)南人，2014級制藥工程專業(yè)本科生；*通信作者：王集會(1962-)，男，副教授，研究方向：蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究。

O657.3

A

1008-021X(2017)05-0078-02