習(xí)雪麗，汪勁松，張新潮，王衛(wèi)東，柳亞鵬，潘繼承

(湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

靈芝糖蛋白與人源蛋白RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的相互作用

習(xí)雪麗，汪勁松，張新潮，王衛(wèi)東，柳亞鵬，潘繼承

(湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

采用酶輔助超聲提取法，利用DEAE-Sephadex A25 離子層析分離得到一種天然靈芝糖蛋白GP2。經(jīng)SDS-PAGE檢測，以高碘酸希夫試劑染色得到單一條帶，說明此組分為單一糖蛋白，紅外檢測分析證實(shí)此組分(GP2)為糖蛋白。熒光檢測結(jié)果表明，此糖蛋白導(dǎo)致人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域(eRANKL)內(nèi)源熒光減弱，ANS熒光增強(qiáng)，推測此組分可能會使該蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。

靈芝；糖蛋白；純化；人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域

靈芝是一種營養(yǎng)，保健價(jià)值極高的大型擔(dān)子菌，其所含多糖類具有抗腫瘤生長、減少化療毒副作用、鎮(zhèn)靜安神、提高機(jī)體免疫力、強(qiáng)心、降血脂血壓、保護(hù)肝臟、降血糖、抗氧化、抗衰老等作用[1]。為提高多糖的提取率，目前大多在提取前對靈芝子實(shí)體或菌絲體采取預(yù)處理。方法有微波處理法、酶法、超聲波法、冷凍法等。探究靈芝多糖對腫瘤細(xì)胞的藥理學(xué)活性，進(jìn)一步探索其藥效機(jī)制，近年來，已成為熾手可熱的研究課題，而多糖與機(jī)體功能性蛋白相互作用的研究，勢必為多糖生物活性的探討提供生化水平的佐證，為細(xì)胞水平靶蛋白的尋找提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κ B Ligand, RANKL)是一種II型跨膜蛋白，由一簡短N(yùn)-端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和一類似TNF(tumor necrosis factor，腫瘤壞死因子)核心胞外保守結(jié)構(gòu)域組成，屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，主要表達(dá)于激活的T細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞及成骨細(xì)胞[2-3]，在成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、軟骨基質(zhì)周圍肥大型軟骨細(xì)胞中亦有表達(dá)。RANKL是一種強(qiáng)效破骨因子，通過與巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)結(jié)合，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成。文獻(xiàn)報(bào)道，RANK與RANKL強(qiáng)的相互作用是RANK/RANKL信號通路及破骨細(xì)胞形成的必備條件，輕微干擾二者的相互結(jié)合即可對破骨細(xì)胞的形成產(chǎn)生顯著影響[3]。RANKL-RANK異源六聚體是通過三個(gè)RANK單體分別插入一個(gè)RANKL三聚體相鄰單體間的縫隙而形成，可見RANKL三聚體的存在形態(tài)對其功能具有至關(guān)重要的作用。RANKL除了在骨相關(guān)疾病中有重要作用，在免疫系統(tǒng)，體溫調(diào)節(jié)，癌癥轉(zhuǎn)移，妊娠期及荷爾蒙誘導(dǎo)的乳腺的發(fā)育中同樣至關(guān)重要。有理由相信，RANKL是一種治療相關(guān)疾病的重要靶點(diǎn)[4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

含有pET-21b-RANKL的E.coli BL21菌種，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH值7.0)；靈芝購自云南海南；蛋白胨，酵母提取物購自O(shè)XIOD，IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、Amp(氨芐青霉素)、Kan(卡那霉素)均為國產(chǎn)分析純，DEAE纖維素柱(二乙氨基乙基纖維素)購自上海寶曼生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

eRANKL蛋白質(zhì)的制備：取本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建成功的含有pET-21b-RANKL的E.coli BL21甘油菌20 μL接種于6 mL的LB試管培養(yǎng)基(已加入氨芐，工作濃度為100 μg/mL)，置于37 ℃搖床，恒溫培養(yǎng)12 h；向大體積LB培養(yǎng)基中加入0.5%已活化好的菌液，置于37 ℃搖床，恒溫培養(yǎng)2～3 h；擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD值在0.6～0.8之間時(shí)，向菌液中加入IPTG使其工作濃度為0.2 mmol/L，置于20 ℃搖床，恒溫培養(yǎng)12 h；將誘導(dǎo)后的菌液離心(5000 r/min，10min)收集細(xì)胞沉淀，以蒸餾水洗沉淀一次；將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞裂解液中，于冰浴中超聲破壁，于4 ℃，離心(12000 r/min，10min)，取上清，即為粗蛋白提取液；采用His-tag/Ni親和層析方法純化，SDS-PAGE，Western blot檢測。

靈芝多糖的提取與純化：取干靈芝50 g，粉碎，醇沉24 h，抽濾，向沉淀中按m(靈芝)∶v(水)= 1∶20的比例加水混勻，并向混合液中加入0.06%木聚糖酶，置于55 ℃搖床中，酶解1 h，超聲破壁，置78 ℃水浴3 h；離心, 取上清，并向其中加入4倍體積工業(yè)酒精，4 ℃醇沉24 h，離心，取沉淀，即得粗糖；向粗糖中加入適量二次蒸餾水，78 ℃水浴30 min，抽濾，DEAE-Sephadex A25 離子層析，以Tris-HCl(pH值=7.0)為緩沖液，NaCl濃度梯度洗脫液，收集；用SDS-PAGE(12%分離膠，5%濃縮膠)進(jìn)行多糖檢測，以高碘酸希夫試劑染色；靈芝多糖的紅外光譜檢測。將所得GP2以KBr壓片，通過紅外光譜儀掃描，掃描范圍4000～400 cm-1。

靈芝多糖與人源eRANKL胞外結(jié)構(gòu)域的熒光光譜檢測：終濃度為15 μmol/L的eRANKL與不同濃度的糖蛋白于37 ℃恒溫水浴30min，激發(fā)波長295 nm，掃面波長范圍300～400 nm，測定其內(nèi)源熒光。ANS熒光檢測：向上述體系中各加入1～3 μL ANS(蛋白濃度約為ANS濃度的25倍)，避光反應(yīng)30 min，參數(shù)設(shè)定為激發(fā)波長380 nm，掃描波長范圍400～600 nm，測定ANS熒光光譜。

2 結(jié)果

2.1 Western blot 鑒定重組RANKL胞外結(jié)構(gòu)域

結(jié)果如圖1所示，表明eRANKL基因已經(jīng)表達(dá)，其蛋白已純化。

1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2.eRANKL；3. eRANKL/Western blot圖1 人源eRANKL胞外結(jié)構(gòu)域SDS-PAGE及 Western blot結(jié)果

2.2 靈芝糖蛋白經(jīng)DEAE-Sephadex A25純化

圖2 靈芝糖蛋白經(jīng)DEAE-Sephadex A25純化的洗脫曲線

取經(jīng)過脫蛋白，透析及離心處理的粗多糖，上樣，以Tris-HCl(pH值為7.0)為緩沖液，先后以0.1、0.3、0.5、0.8 mol/L NaCl為洗脫液，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)合苯酚-硫酸法檢測知[5]，由0.3 mol/L NaCl洗脫所得多糖的總糖含量最大，將此組分命名為GP-2，結(jié)合考馬斯亮藍(lán)法測得，此組分中m總糖∶m蛋白質(zhì)= 40∶1，在經(jīng)過20次脫蛋白處理后，仍有蛋白尚存，推測此蛋白可能是穩(wěn)定結(jié)合在多糖上的多肽類物質(zhì)[6]，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以此組分作為主要研究對象。

認(rèn)知因素主要包括兒童對社會性行為的認(rèn)識和對情景信息的識別等。近年來，國外的一系列研究揭示了兒童的社會認(rèn)知特別是對突然行為意圖的認(rèn)知對兒童攻擊性行為的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)兒童把自己所面臨的消極后果知覺為同伴有意造成的時(shí)候，一般傾向于對同伴做出報(bào)復(fù)性攻擊；反之，如果認(rèn)為同伴是由于意外或出于善意的動機(jī)而給他造成了消極后果時(shí)，一般傾向于消釋其惡意認(rèn)定。同時(shí)，攻擊性與非攻擊性兒童對他人行為意圖認(rèn)知存在著差異，攻擊性兒童在他人行為意圖不明時(shí)傾向于做出敵意性歸因。

2.3 靈芝糖蛋白的SDS-PAGE檢測

取GP-2經(jīng)SDS-PAGE電泳，以高碘酸西弗試劑染色，得一單一條帶[7]，證明所得GP-2可能為純多糖或糖蛋白，電泳圖譜如圖3。

圖3 靈芝糖蛋白的SDS-PAGE經(jīng)高碘酸西弗試劑染色

2.4 靈芝糖蛋白的紅外光譜檢測

由DEAE纖維素柱純化所得GP-2，經(jīng)對水透析，真空冷凍干燥等處理后所得干粉GP-2以KBr壓片，經(jīng)過紅外光譜儀掃描，得到圖譜如圖4所示。

圖4 靈芝糖蛋白的紅外光譜圖

在3600～3200 cm-1之間有一強(qiáng)峰，說明存在著分子內(nèi)或分子間氫鍵O-H的伸縮振動；在3000～2800 cm-1之間有一強(qiáng)峰是糖類C-H伸縮振動；在1637.4 cm-1是CH3CONH-的酰胺I譜帶；1400～1200 cm-1之間的峰是C-H的變角振動，；880.7 cm-1處的特征吸收，說明此糖為β-D-甘露吡喃糖[8]。

2.5 靈芝糖蛋白與人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的熒光譜分析

eRANKL終濃度為15μmol/L，曲線1至6的糖蛋白的濃度分別為0, 4, 8, 12, 16, 20 mg/mL

圖5 靈芝糖蛋白與重組人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的

內(nèi)源熒光光譜

eRANKL終濃度為15μmol/L，曲線2至7的糖蛋白的濃度分別為0, 4, 8, 12, 16, 20 mg/mL，曲線1為ANS對照

圖6 靈芝糖蛋白與重組人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的

ANS熒光光譜

靈芝糖蛋白與重組人源RANKL胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的內(nèi)源熒光光譜如圖5所示，ANS熒光檢測結(jié)果如圖6所示。

由圖5可知：靈芝糖蛋白的加入使得RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的熒光強(qiáng)度降低，且呈劑量依賴關(guān)系，表明靈芝糖蛋白的加入有可能使得RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的色氨酸的微環(huán)境發(fā)生了改變。

由圖6可知：靈芝糖蛋白的加入使得RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的ANS熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且呈劑量依賴關(guān)系，說明糖蛋白的加入促進(jìn)了RANKL胞外結(jié)構(gòu)域疏水面，推測蛋白結(jié)構(gòu)有可能變得更疏松。

3 討論

本研究選用木聚糖酶輔助超聲破壁的方法提取靈芝多糖，不單縮短了提取多糖所需時(shí)間，也提高了多糖的得率，且獲得的多糖純度較高。熒光光譜學(xué)研究結(jié)果表明，靈芝糖蛋白可以導(dǎo)致eRANKL構(gòu)象改變，進(jìn)而干預(yù)RANKL與其受體RANK結(jié)合，因此靈芝多糖有望成為以RANKL/RANK信號通路為靶點(diǎn)的天然無毒副作用新藥，值得進(jìn)一步研究。

[1] Yang F,Liu C．The influence of environmental conditions on polysacchafides fomation by Ganoderma lucidum in submerged fermentations[J].Process Biochemistry，1998，33: 547-553.

[2] Lam J,Nelson C A,Ross F P,et al.Crystal structure of the TRANCE/RANKL cytokine reveals determinants of receptor-ligand specificity[J].J Clin Invest,2001,108: 971-979.

[3] Ito S,Wakabayashi K,Ubukata O,et al.Crystal structure of the extracellular domain of mouse RANK ligand at 2.2-A resolution[J].J Biol Chem,2002,277: 6631-6636.

[4] Douni E,Rinotas V,Makrinou E,et al.A RANKL G278R mutation causing osteopetrosis identifies a functional amino acid essential for trimer assembly in RANKL and TNF[J]. Hum Mol Genet,2012,21:784-798.

[5] 張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1994.

[6] Peng Yanfei,Zhang Lina.Characterization of a polysaccharide-protein complex from Ganoderma tsugae mycelium by size-exclusion chromatography combined with laser light scattering[J]J Biochem Biophys Methods,2003,56:243-252.

[7] Liu J,Yang F,Ye L B,et al.Possible mode of action of antiherpetic activities of a proteoglycan isolated from the mycelia of Ganoderma lucidum in vitro[J].Journal of Ethnopharmacology,2004,95:265-272.

[8] Barker S A,Bourne E J,Stacey M.Infrared spectra of carbohydrates. Part I. Some derivatives of D -glucopyranose[J].Journal of the Chemical Society,1954,1:171-176.

(本文文獻(xiàn)格式：習(xí)雪麗，汪勁松，張新潮，等.靈芝糖蛋白與人源蛋白RANKL胞外結(jié)構(gòu)域的相互作用[J].山東化工,2017,46(5):31-33.)

Studies on the Interaction Between Extracellular Domain of Human RANKL with Bioactive Glycoprotein

XiXueli,WangJinsong,ZhangXinchao,WangWeidong,LiuYapeng,PanJicheng

(College of Life,Hubei Normal University,Huangshi 435002,China)

Osteoprotegerin(OPG) and receptor activator of nuclear factor kappa B (RANK) are members of the TNFR superfamily that regulate osteoclast formation and function by competing for RANK ligand (RANKL). RANKL promotes osteoclast development through RANK activation,while OPG inhibits this process by sequestering RANKL. In this paper, a natural ganoderma glycoprotein was harvested by the means of ultrasonic assisted, enzymatic action and DEAE-Sephadex A25 ion chromatography. The homogeneous glycoprotein from ganoderma was identified by SDS-PAGE, stained with Acid-Schiff regent and infrared analysis. Fluorescence analysis indicated that the glycoprotein could result eRANKL intrinsic fluorescence intensity dropping and ANS fluorescence intensity increasing,which suggested the glycoprotein caused the eRANKL’s conformational change.

ganoderma;glycoprotein;purification;human extracellular domain of RANKL

2016-01-13

習(xí)雪麗(1987—)，女，湖北襄陽人，碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能；通訊作者：潘繼承，教授。

TQ936.22

A

1008-021X(2017)05-0031-03