魏 娟 ，吳文娟，孫玉杰，祝光耀，趙 臻

(1．天方藥業(yè) 生物技術(shù)研究所，河南駐馬店 463000；2. 天方藥業(yè) 第二化驗(yàn)室河南駐馬店 463000；3. 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院 上海 200237；4.天方藥業(yè)技術(shù)管理部，河南 駐馬店 463000)

去甲基金霉素高產(chǎn)菌株篩選

魏 娟1，吳文娟2，孫玉杰1，祝光耀3，趙 臻4*

(1．天方藥業(yè) 生物技術(shù)研究所，河南駐馬店 463000；2. 天方藥業(yè) 第二化驗(yàn)室河南駐馬店 463000；3. 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院 上海 200237；4.天方藥業(yè)技術(shù)管理部，河南 駐馬店 463000)

本課題對(duì)金色鏈霉菌進(jìn)行四種處理：自然分離、紫外誘變、EMS誘變、菌種馴化。其中自然分離得到的CM-23菌株效價(jià)達(dá)到2730u/mL，提高了11.42%；紫外誘變得到的UC-11菌株效價(jià)達(dá)到3127u/mL，提高了27.63%；EMS誘變得到的EC-18菌株效價(jià)達(dá)到2789u/mL，提高13.84%；菌種馴化得到的CM3000-3菌株效價(jià)達(dá)到3839u/mL，提高了56.69%。通過比較這四種處理方法，發(fā)現(xiàn)菌種馴篩選到CM3000-3提高最多，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他誘變方法所篩選到的最高菌株。這實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為其他有特定靶位點(diǎn)的抗生素的高產(chǎn)菌株的誘變篩選提供參考。

去甲基金霉素； 篩選; 菌株 ; 金色鏈霉菌

去甲基金霉素(Demethylchlortetracycline，簡(jiǎn)稱DMCTC)，是一種廣譜的抗生素。屬于四環(huán)素類抗生素，與金霉素結(jié)構(gòu)相似。在臨床上，去甲基金霉素可用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌引發(fā)的疾病，如肺炎、尿路感染、細(xì)菌性痢疾、布氏桿菌病及小兒獲紅熱等疾病。且其具有易被人體吸收、且排泄慢、高效性、長(zhǎng)效性等特點(diǎn)，因此去甲基金霉素在醫(yī)藥行業(yè)中一種運(yùn)用十分廣泛的抗生素[1-2]。目前，去甲基金霉素市場(chǎng)需求量大，而來源比較單一。主要從生物發(fā)酵中獲得，因此如何選育出高產(chǎn)的去甲基金霉素生產(chǎn)菌具有較大的經(jīng)濟(jì)意義。

得到去甲基金霉素生產(chǎn)菌高產(chǎn)菌株主要通過兩種途徑：一、自然分離；二、誘變育種。通過自然分離選育出的高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量比較穩(wěn)定，且不易退化。但是自然分離的突變率低、過程慢且不定向性較大。而菌種誘變是篩選高產(chǎn)菌株的簡(jiǎn)單實(shí)用的方法。可以大幅度提高突變率，從而可以篩選到狀優(yōu)良的菌株。目前，常用有物理誘變、化學(xué)誘變等，同時(shí)，以具有特定靶位點(diǎn)的抗生素為誘變劑進(jìn)行菌種誘變時(shí)，能夠得到較多的正向突變菌株。因?yàn)槲⑸锟梢酝ㄟ^反饋抑制和反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的過量積累，所以篩選抗高濃度自身代謝產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物的抗反饋或抗阻遏突變株，也是獲得高產(chǎn)突變菌株的一種有效途徑[3]。

1 材料與方法

1.1 菌種

金色鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)cmctc-H，華東理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 固體培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖 10、磷酸二氫鉀 0.4、天冬酰胺 0.25、牛肉浸膏 2、瓊脂條20、去離子水配制，調(diào)pH為6.8～7.0，28±0.5℃，培養(yǎng)12～16天。

1.2.2 種子培養(yǎng)基(g/L)

玉米淀粉 30、黃豆餅粉 30、酵母粉 2、大豆蛋白胨 5、磷酸二氫鉀 1.5、硫酸銨 2、碳酸鈣 10 、pH自然，豆油0.5mL/250 mL三角瓶，28±0.5℃，220r/min，培養(yǎng)2天。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)

黃豆餅粉30、玉米漿 3、L-賴氨酸鹽 8、氯化鈉 3、磷酸二氫鉀 0.6、硫酸銨 2、玉米淀粉 80、α-淀粉酶 0.08、碳酸鈣 10，pH自然，豆油0.3mL/250 mL三角瓶，28±0.5℃，220r/min，培養(yǎng)7天。

1.3 誘變育種方法

1.3.1 自然分離

由于菌株容易發(fā)生退化，因此在使用該出發(fā)菌株前進(jìn)行復(fù)壯，以便得到性狀優(yōu)良的出發(fā)菌株。

本實(shí)驗(yàn)來之實(shí)驗(yàn)室保藏的甘油管。打開保藏金色鏈霉菌甘油管，加無菌水稀釋后，分別涂布于平板培養(yǎng)基上，28±0.5℃培養(yǎng)14～16d，將孢子長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落劃線于到斜面上，再在28±0.5℃培養(yǎng)14～16d。將長(zhǎng)好旳斜面接種于種子培養(yǎng)基中，28±0.5℃，220r/min培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)好的種子液以10%接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28±0.5℃，220r/min培養(yǎng)7d。通過測(cè)定效價(jià)挑選出效價(jià)較高的菌株備用。

1.3.2 紫外誘變[4-5]

1.3.2.1 金色鏈霉菌單孢子懸液的制備

取孢子長(zhǎng)勢(shì)較好的金色鏈霉菌斜面，加入5mL無菌水，用已滅菌的鐵鏟將金色鏈霉菌孢子輕輕地刮下來，將刮下的金色鏈霉菌孢子懸液用移液管轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的50mL的三角瓶中，28±0.5℃，100r/min震蕩20min，用已滅菌棉花漏斗過濾備用。

1.3.2.2 無菌條件下，分別吸取3mL金色鏈霉菌單孢子懸液于無菌帶磁力攪拌器的平皿中，放在紫外燈(紫外燈功率為50W，照射距離30cm)下分別進(jìn)行照射30 ,60 ,90 ,120,150 s，將處理后的金色鏈霉菌孢子懸液以10-1,10-2,10-3,10-4,10-5依次稀釋并涂布于平板上。28±0.5℃培養(yǎng)14-16d。并以處理前的菌株作為對(duì)照。

1.3.3 EMS誘變[6]

1.3.3.1 金色鏈霉菌單孢子懸液的制備：取金色鏈霉菌孢子長(zhǎng)勢(shì)較好的斜面，加入5mL無菌水，用已滅菌的鐵鏟將金色鏈霉菌孢子輕輕地刮下來，將刮下的金色鏈霉菌孢子液用移液管轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的100mL的三角瓶中，28±0.5℃，100r/min震蕩20min，用已滅菌棉花漏斗過濾備用。

1.3.3.2 分別取5mL金色鏈霉菌單孢子懸液于50mL三角瓶中，各加入5μl的EMS，28±0.5℃，220r/min分別震蕩培養(yǎng)1 ,2,3 ,4,5 h，將處理后的金色鏈霉孢子懸液以10-1,10--210-3,10-4,10-5依次稀釋并涂布于平板上。28±0.5℃培養(yǎng)14-16d。并以處理前的菌株作為對(duì)照。

1.3.4 菌種馴化[7]

金色鏈霉菌先在種子培養(yǎng)基中活化，然后依次2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000U增加去甲基金霉素在種子培養(yǎng)基的含量，將處理后的種子液以10-1,10-2,10-3,10-4,10-5依次稀釋，并涂布于相應(yīng)抗性平板上。28±0.5℃培養(yǎng)14～16d。并以處理前的菌株作為對(duì)照。

1.4 檢測(cè)方法

高效液相色譜法

色譜柱的型號(hào)：Extend-C18(4.6 mm×150 mm 5μm)，流動(dòng)相：準(zhǔn)確稱取草酸0.9 g和草酸銨10 g并用dd水定容至1000 mL，然后依次加入300 mL乙腈、200 mL甲醇，混勻，超聲波脫氣30 min備用。柱溫：25℃。等梯度洗脫，流速：0.4 mL/min進(jìn)樣量：3μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然分離

通過自然分離純化，挑取孢子豐滿且菌落較大的單菌落，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在考察的單菌落中，最終獲得CM-23菌株效價(jià)最高(如圖1所示)。

圖1 自然分離高產(chǎn)菌株CM-23結(jié)果

由圖1可知：自然分離出發(fā)菌株效價(jià)為2450 u/mL左右，經(jīng)自然分離得到的CM-23菌株F3代效價(jià)為2730u/mL，提高11.42%。且F1、F2、F3代相對(duì)比較穩(wěn)定，與初篩結(jié)果相比，其效價(jià)穩(wěn)定。自然分離得到的高產(chǎn)菌株一般效價(jià)比較穩(wěn)定且不易退化，但是得到高產(chǎn)菌株的工作量比較大且提高幅度小。

2.2 紫外誘變

2.2.1 紫外誘變條件確定

通過上述不同紫外照射時(shí)間孢子懸液與未處理的孢子懸液不同稀釋度的平板菌落數(shù)可得：紫外照射時(shí)間與金色鏈霉菌致死率關(guān)系(如圖2所示)。

圖2 紫外誘變致死曲線

由圖2可知：隨著紫外照射時(shí)間越長(zhǎng)，其致死率越高。一般情況下，正變率隨著紫外照射時(shí)間越長(zhǎng)，其正突變率越小。綜合這兩種情況，我們選取紫外照射90s為最佳照射時(shí)長(zhǎng)。

2.2.2 紫外誘變高產(chǎn)菌株篩選

選取紫外照射90s孢子懸液涂布的平板，挑取孢子豐滿且菌落較大的單菌落，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在考察的單菌落中，UC-11菌株效價(jià)最高(如圖3所示)。

由圖3可知：紫外誘變出發(fā)菌株效價(jià)為2450 u/mL左右，經(jīng)紫外誘變得到的UC-11菌株F3代效價(jià)為3127u/mL，提高27.63%。且F1、F2、F3代相對(duì)比較穩(wěn)定，與初篩結(jié)果3315 u/mL相比，其效價(jià)降低較多。紫外誘變得到的高產(chǎn)菌株概率較大且提高較多，但是紫外誘變得到高產(chǎn)菌株易發(fā)生回復(fù)突變。

圖3 紫外誘變高產(chǎn)菌株UC-11結(jié)果

2.3 EMS誘變

2.3.1 EMS誘變條件確定

通過上述不同EMS孢子懸液與未處理的孢子懸液不同稀釋度的平板菌落數(shù)可得：EMS劑量與金色鏈霉菌致死率關(guān)系(如圖4所示)。

圖4 EMS誘變致死曲線

由圖4可知：隨著EMS處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其致死率越高。當(dāng)EMS處理時(shí)間為2h時(shí)，菌體致死率達(dá)到90%以上?？紤]到一般情況下，致死率越高，其正突變率越小。綜合這兩種情況，我們選取EMS處理2h為最佳時(shí)長(zhǎng)。

2.3.2 EMS高產(chǎn)菌株的篩選

選取EMS處理時(shí)間為2h的孢子懸液涂布的平板，挑取孢子豐滿且菌落較大的單菌落，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在考察的單菌落中，EC-18菌株最終提高13.84%(如圖5所示)。

由圖5可知：EMS誘變出發(fā)菌株效價(jià)為2450 u/mL左右，經(jīng)EMS誘變得到的EC-18菌株F3代效價(jià)為2789u/mL，提高13.86%。且F1、F2、F3代相對(duì)比較穩(wěn)定，與初篩結(jié)果相比，其效價(jià)穩(wěn)定。但是EMS誘變后，菌株提高并不明顯，與自然分離的CM-23菌株效價(jià)一致，因此我們認(rèn)為EMS誘變結(jié)果并不理想。

圖5 EMS誘變高產(chǎn)菌株EC-18結(jié)果

2.4 馴化

在去甲基金霉素添加量為2000,3000,4000U時(shí)，平板上單菌落相對(duì)較多，但是當(dāng)去甲基金霉素添加量再增加時(shí)，平板上幾乎不能長(zhǎng)出菌落。在考察的單菌落中，CM3000-3菌株提高最多(如圖6所示)。

由圖6可知：馴化出發(fā)菌株效價(jià)為2450 u/mL左右，經(jīng)馴化后得到的CM3000-3菌株F3代效價(jià)為3839u/mL，提高56.69%。且F1、F2、F3代相對(duì)比較穩(wěn)定。與初篩結(jié)果3974u/mL相比，其效價(jià)相對(duì)穩(wěn)定。去甲基金霉素對(duì)金色鏈霉菌有反饋抑制作用，通過馴化來篩選出抗自身代謝物反饋的高產(chǎn)菌株是一個(gè)篩選去甲基金霉素高產(chǎn)菌株的理想方法。

圖6 馴化高產(chǎn)菌株CM3000-3結(jié)果

2.5 方法比較

本實(shí)驗(yàn)對(duì)去甲基霉素生產(chǎn)菌同時(shí)以自然分離、紫外誘變、EMS誘變、菌種馴化四種方法進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選，達(dá)到理想效果(如圖7所示)。

由圖7可知：對(duì)去甲基霉素生產(chǎn)菌進(jìn)行誘變后，其中馴化效果最為突出提高了56.69%，紫外誘變效果次之提高了27.63%，但EMS誘變的得到的最高菌株生產(chǎn)能力與自然篩選相當(dāng)，因此本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為EMS誘變對(duì)去甲基霉素高產(chǎn)菌株篩選作用不是太強(qiáng)。通過四種處理方法的比較，我們可以認(rèn)為微生物可以通過反饋抑制和反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的過量積累，所以篩選抗高濃度自身代謝產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物的抗反饋或抗阻遏突變株，也是獲得高產(chǎn)突變菌株的一種有效途徑。

圖7 不同誘變方法對(duì)比

3 展望查

目前去甲金霉素，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究的文獻(xiàn)較少，且產(chǎn)量也不高。但由于去甲金霉素是及其重要的抗生素，且本身也是合成其他新型抗生素的重要中間體，因此國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的應(yīng)用十分巨大。隨著其在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的應(yīng)用越來越大，選育出其高產(chǎn)菌株成為亟待解決的問題。

金色鏈霉菌生產(chǎn)去甲基金霉素是一個(gè)復(fù)雜的次級(jí)代謝過程，在其遺傳背景仍不十分明確的前提下，誘變育種仍是目前獲得抗生素高產(chǎn)菌的主要手段。無論是其自發(fā)還是誘發(fā)的突變株，突變的隨機(jī)性都非常大，正突變株的出現(xiàn)頻率往往較低，傳統(tǒng)的育種方法需要進(jìn)行大量的篩選工作。大量的實(shí)踐證明，利用自身代謝物的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)的特性，將抗生素抗性篩選法與誘變育種方法相結(jié)合，可以克服微生物選育過程中傳統(tǒng)篩選方法盲目性大、工作量多等缺點(diǎn)?？煽焖?、有效地獲得理想的抗生素高產(chǎn)突變株，大大地提高菌種選育工作效。

[1] 賀筱蓉, 李永泉. 原生質(zhì)體誘變選育去甲基金霉素高產(chǎn)菌[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)理學(xué)版 1997(2):170-177.

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(本文文獻(xiàn)格式：魏 娟，吳文娟，孫玉杰，等.去甲基金霉素高產(chǎn)菌株篩選[J].山東化工，2017，46(14)：114-116，118.)

2017-05-09

魏 娟(1987—)，女，天方藥業(yè)生物技術(shù)研究所研究員，獲得碩士學(xué)位，主要從事微生物學(xué)研究；通信作者：趙 臻(1989—)，項(xiàng)目管理員，學(xué)士，主要從事研發(fā)項(xiàng)目及成果管理。

Q93

A

1008-021X(2017)14-0114-03