劉艷琴 柴貴明 梁莉 劉宗益/內(nèi)蒙古巴彥淖爾烏拉特中旗農(nóng)牧業(yè)局動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

韓文芳/內(nèi)蒙古巴彥淖爾市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

范艷麗 丁博/ 內(nèi)蒙古巴彥淖爾五原縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

種羊布病虎紅平板凝集與競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)的對(duì)比分析

劉艷琴 柴貴明 梁莉 劉宗益/內(nèi)蒙古巴彥淖爾烏拉特中旗農(nóng)牧業(yè)局動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

韓文芳/內(nèi)蒙古巴彥淖爾市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

范艷麗 丁博/ 內(nèi)蒙古巴彥淖爾五原縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

布魯氏菌?。˙rucellosis），簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏菌屬（brucellosis）細(xì)菌引起人與動(dòng)物共患的變態(tài)反應(yīng)性傳染病，嚴(yán)重地威脅著人類健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)。歷史上，布魯氏菌病在我國(guó)曾經(jīng)是危害極為嚴(yán)重的人獸共患傳染病之一。解放后，布魯氏菌病的防治得到高度重視，被列為二類法定傳染病。

從我國(guó)不同年代家畜布病感染狀態(tài)分析，在上世紀(jì)50-60年代家畜感染布病明顯高于70-80年代，自70年代后開始下降，80年代末期已下降到有史以來的最低點(diǎn)，90年代初期平均感染率除羊外，牛和豬都達(dá)到我國(guó)規(guī)定的控制標(biāo)準(zhǔn)。布魯氏菌病的防控始于50年代中期，我國(guó)始終重視布魯氏菌病的防治工作，有組織有計(jì)劃的進(jìn)行人畜布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查。然后是60、70年代對(duì)高危家畜進(jìn)行疫苗防治，發(fā)病率明顯下降，取得了顯著成果。

在上世紀(jì)50、60年代時(shí)烏拉特中旗發(fā)生過布病，但由于各級(jí)政府及業(yè)務(wù)部門高度重視布病防治工作，堅(jiān)持畜間防治以免疫為主，免、檢、監(jiān)測(cè)、淘汰陽性畜相結(jié)合的綜合防控措施，至上世紀(jì)90年代，布病基本得到了控制。進(jìn)入本世紀(jì)以后，隨著加大農(nóng)牧業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整力度，巴彥淖爾烏拉特中旗旗又是畜牧業(yè)大旗，畜牧業(yè)地位不斷提升，農(nóng)牧民養(yǎng)殖態(tài)度積極，外購(gòu)牲畜比重逐年增加。由于牲畜購(gòu)入渠道繁多，流通監(jiān)管難，導(dǎo)致周邊及外來牲畜流入巴彥淖爾烏拉特中旗旗引發(fā)布病疫情。

隨著當(dāng)今世界的國(guó)際化貿(mào)易，布病的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)工作已成為貿(mào)易流通中極其重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。雖然國(guó)際獸醫(yī)局（OIE）編寫了動(dòng)物傳染病的診斷方法及疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)已統(tǒng)一各成員國(guó)檢測(cè)方法及結(jié)果差異，不同實(shí)驗(yàn)室間，即使用同一份血清，由于條件差異或者用不同的方法檢測(cè)所得結(jié)果也會(huì)有所差異，在實(shí)際檢測(cè)過程中還有很多問題值得探討。因?yàn)樵诓疾》揽毓ぷ髦?，政府要投入大量的人力、?cái)力、物力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、撲殺補(bǔ)貼，因此，選擇合理、可靠的檢測(cè)方法，科學(xué)準(zhǔn)確的做出結(jié)果，才能最終達(dá)到有效控制布病的效果，避免在撲殺過程中誤殺、漏殺，進(jìn)而減少農(nóng)牧民的經(jīng)濟(jì)損失。

一、材料和方法

1.種羊。巴彥淖爾烏拉特中旗地區(qū)的兩個(gè)種羊場(chǎng)的115只種羊全部進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所有檢測(cè)羊均未接種過S19疫苗或口服豬2號(hào)疫苗。

2.試劑。布魯氏菌虎紅平板試驗(yàn)抗原，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)，批號(hào)20161003，規(guī)格15 ml/瓶，陰性血清，陽性血清。布魯氏桿菌抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒，北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格96T×2/盒。

3.方法。布魯菌病抗體檢測(cè)按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/ T18646-2002）操作，布魯菌抗體檢測(cè)按照ELISA檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。采用5 ml一次性采血器，每只羊頸靜脈采血2～3 ml，分離血清后進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)。同時(shí)將所采血清用競(jìng)爭(zhēng)ELISA（cELISA）試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。所有的血清樣品用兩種方法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，以確定RBPT與c-ELISA檢測(cè)結(jié)果的符合率。

二、結(jié)果與分析

1.總體情況。

本次實(shí)驗(yàn)室共檢測(cè)血清115頭份，RBPT陽性頭數(shù)46頭份，RBPT陽 性 率40%；c-ELISA陽性頭數(shù)23頭份，c-ELISA陽性率20%。

其中種公羊46頭份，RBPT陽性血清13頭份，布病虎紅陽性率28.26%；檢測(cè)種母羊69頭份，RBPT陽性血清33頭份，布病虎紅陽性率47.83%。

c-ELISA共檢測(cè)115頭份，其中種公羊46頭份，c-ELISA陽性血清8頭份，布病c-ELISA陽性率17.39%；檢測(cè)種母羊69頭份，結(jié)果的符合率為50%，競(jìng)爭(zhēng)ELISA更準(zhǔn)確，RBPT的假陽性率達(dá)到50%。種母羊的血清進(jìn)行RBPT檢測(cè)時(shí)，33份RBPT陽性血清c-ELISA僅確認(rèn)了15份陽性。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這部分羊血清進(jìn)行RBPT時(shí)弱陽性的數(shù)量比較多，血清與抗原混合以后3～5min后，才會(huì)顯現(xiàn)出極細(xì)小的顆粒，在進(jìn)行ELISA確認(rèn)時(shí)測(cè)得結(jié)果為陰性，RBPT為陽性。從而也表明RBPT受人為判定標(biāo)準(zhǔn)的影響是比較大的，假陽性率較高。

三、討論與結(jié)論

1.血清學(xué)診斷是診斷布魯菌病的主要手段，且血清學(xué)診斷方法較c-ELISA陽性血清15頭份，布病c-ELISA陽性率21.74%。

2. RBPT與競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果比較。

69頭份RBPT陰性血清中，競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)陽性數(shù)為2，陽性率2.9%，分析有可能是患畜初期感染布病，抗體未達(dá)到RBPT檢測(cè)的含量，RBPT檢出陰性；c-ELISA的敏感性高，檢出2份陽性血樣。RBPT及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果比較見表2。

表1 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果

表2 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果比較

從整體檢測(cè)結(jié)果看，兩種試驗(yàn)多，尤其RBPT是目前我國(guó)基層單位群體篩查的主要檢測(cè)方法。但血清學(xué)檢測(cè)方法存在兩個(gè)方面問題：一是血清學(xué)假陽性反應(yīng)，原因是由于某些革蘭氏陰性細(xì)菌感染，如小腸結(jié)腸耶爾森0:9，大腸桿菌0：157等，這些細(xì)菌表面的脂多糖O鏈抗原與光滑型布魯菌表面脂多糖有交叉的抗原結(jié)構(gòu)（C/Y）;二是免疫動(dòng)物血清中的抗體干擾常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)，造成誤判結(jié)果，導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究表明傳統(tǒng)的血清學(xué)方法和間接ELISA均無法排除假陽性反應(yīng)，競(jìng)爭(zhēng)ELISA(c-ELISA)可以排除血假陽性反應(yīng)。用ELISA檢測(cè)布魯菌病是一項(xiàng)新技術(shù)，1976年 Cavleson等是最先應(yīng)用ELISA檢測(cè)牛布病抗體并發(fā)現(xiàn)其敏感性比試管凝集試驗(yàn)高10～100倍。目前世界上比較成熟的檢測(cè)布病的ELISA方法包括競(jìng)爭(zhēng)ELISA(cELISA)和間接ELISA（iELISA）兩種，iELISA的敏感性較高，cELISA的特異性較高，可以排除其他革蘭氏陰性菌引起的假陽性反應(yīng)。

2.本實(shí)驗(yàn)采用的RBPT的優(yōu)點(diǎn)是易操作、簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是存在假陽性反應(yīng)，特異性差，且存在人為判定因素影響 ，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RBPT的假陽性率在50%，這與曹杰，齊長(zhǎng)明等人的試驗(yàn)結(jié)果40%～50%基本一致。在結(jié)果判定時(shí)，凡凝集反應(yīng)緩慢、顆粒細(xì)小的，應(yīng)判為可疑(+)。有實(shí)驗(yàn)證明，虎紅平板凝集試驗(yàn)、和試管凝集試驗(yàn)這兩種診斷方法都會(huì)出現(xiàn)較高比例的假陽性和假陰性。

3.由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能初步說明問題，我們下一步將進(jìn)行大批量動(dòng)物試驗(yàn)，以期獲得更加可靠的數(shù)據(jù)。雖然說布病檢測(cè)的血清學(xué)方法比較多，但目前還沒有一種檢測(cè)方法是在敏感性、特異性、準(zhǔn)確性還是快速簡(jiǎn)便等方面都兼顧的診斷方法。有結(jié)果表明ELISA操作方便，具有較好的敏感性和特異性，建議在檢疫中用敏感性較高的RBPT初篩，用特異性較好的ELISA確診，以得到較好的效果。由于陽性畜的漏檢，為擴(kuò)散蔓延病原提供了條件，陰性畜的誤殺又會(huì)造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失，所以大規(guī)模檢疫時(shí)，可以用價(jià)格低廉、敏感性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單的方法先初篩，然后用敏感性、特異性好的診斷方法復(fù)檢。

（略）