周永春，張 琦，陳琬玲，方 育，李融林，張 璟

·論著·

水通道蛋白4在肺癌裸小鼠模型中的表達及其對腫瘤細胞增殖與遷移的影響研究

周永春1，張 琦2，陳琬玲3，方 育4，李融林2，張 璟2

目的探討水通道蛋白4(AQP4)在肺癌裸小鼠模型中的表達及其對腫瘤細胞增殖與遷移的影響。方法2016年12月于昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院云南省肺癌重點實驗室進行實驗，選取SPF級雄性裸小鼠60只并采用隨機數字法分為對照組與觀察組，每組30只。對照組裸小鼠于背側靠腋窩處皮下注射未轉染的A549肺癌細胞0.2 ml以建立肺癌裸小鼠模型，而觀察組裸小鼠于背側靠腋窩處皮下注射AQP4-shRNA轉染的A549肺癌細胞0.2 ml以建立肺癌裸小鼠模型。比較兩組裸小鼠腫瘤重量、微血管密度(MVD)，AQP4、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達水平。結果觀察組裸小鼠腫瘤重量及MVD低于對照組(P<0.05)。觀察組裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表達水平低于對照組，E-cadherin表達水平高于對照組(P<0.05)。結論APQ4在肺癌裸小鼠模型中表達增強，其可能參與了肺癌的病理生理過程，可在一定程度上促進腫瘤細胞的增殖與遷移。

肺腫瘤；小鼠，裸；水通道蛋白質4

近年來，隨著工業(yè)的發(fā)展、空氣污染加重及人們生活習慣的改變，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前，臨床診療技術不斷提高，使肺癌的早期診斷和治療方法改進，但肺癌患者的5年生存率未改善[1]。水通道蛋白(AQPs)是近年發(fā)現的一組與水通道有關的細胞膜轉運蛋白，其在細胞膜上組成孔道，可影響水跨膜轉運和細胞內外環(huán)境平衡[2]；其種類較多，且分布于不同的組織中，在多種生理活動中發(fā)揮著重要作用[3]。研究表明，AQPs在腫瘤細胞增殖、遷移、擴散及侵襲過程中表達增強[4]。本研究旨在探討水通道蛋白4(AQP4)在肺癌裸小鼠模型中的表達及其對腫瘤細胞增殖與遷移的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性的裸小鼠60只，體質量15～22 g，月齡4～6個月，由北京維通利華實驗動物有限責任公司提供，動物編號：SCXK(滬)2015-0002；飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物中心實驗室SPF環(huán)境中，溫度(24±2)℃，濕度60%～70%。實驗時對實驗動物的處理方式符合動物倫理要求。

1.1.2 實驗試劑 免疫組化化學試劑盒和酶底物購自北京中杉生物科技有限公司；山羊抗兔一抗和二抗購自賽默飛公司；預染液Marker購自美國New England Biolab公司，Ecl發(fā)光液購自美國皮爾斯公司；臺盼藍染液購自上?？婆d生物有限公司；碘伏購自上海翔升實業(yè)有限公司；胎牛血清購自Gibco公司；蘇木精購自美國Sigma-Aldrich；AQP4抗體購自英國Abcam公司；3′3二氨基聯苯胺購自鄭州阿爾法化工有限公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.3 實驗設備與儀器 2123型孵育箱(美國Shellab)；TGL-16G型臺式高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；XS-212-201型光學顯微鏡(南京光電集團股份有限公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電集團股份有限公司)；WD800型微波爐(廣東格蘭仕公司)；HS-ES 500型生物組織石蠟包埋機(金華市華速科技有限公司)；A1004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；研磨器(鞏義市穎輝高鋁瓷廠)；6孔細胞培養(yǎng)板(上海晶安生物科技有限公司)；RM2145石蠟標本切片機(德國LEICA公司)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 2016年12月于昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院云南省肺癌重點實驗室進行實驗，對裸小鼠進行編號并采用隨機數字表法分為觀察組與對照組，每組30只。觀察組裸小鼠體質量16～21 g，平均體質量(17.3±4.6)g；對照組裸小鼠體質量15～22 g，平均體質量(18.1±3.5)g。兩組裸小鼠體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.758，P>0.05)。

1.2.2 模型制備方法 (1)采用10%小牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素、10%非必需氨基酸的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5%的CO2孵育箱中進行肺癌細胞培養(yǎng)，定期換液，3～5 d傳代一次，培養(yǎng)18 h將細胞進行消化、離心和重懸后稀釋為1×106個/L，以2 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板中。(2)以AQP4-shRNA轉染A549肺癌細胞，采用0.4%臺盼藍染色標記活細胞數，裸小鼠背側靠腋窩處經碘伏消毒，觀察組裸小鼠皮下注射AQP4-shRNA轉染A549肺癌細胞0.2 ml(細胞密度：3×107/ml)，對照組裸小鼠皮下注射未轉染的A549肺癌細胞0.2 ml。(3)接種后7～10 d，裸小鼠接種部位出現硬結節(jié)狀組織，以確定建模成功。

1.2.3 標本采集 于造模成功后以離斷頸椎法處死兩組裸小鼠，摘取腫瘤組織，稱重并記錄；腫瘤組織經4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，蘇木素染色，常規(guī)脫水，透片，封片。

1.2.4 觀察指標 (1)腫瘤重量、微血管密度(MVD)：采用A1004N電子天平稱量兩組裸小鼠腫瘤重量；采用CD34標記，于100倍低倍鏡下全面觀察切片以確定血管高密度區(qū)域；在200倍視野下觀察與周圍腫瘤細胞和結締組織成分明顯區(qū)別的任何一個棕色染色的細胞簇作為一個微血管，只要結構不相連，其分支結構也可作為一個微血管進行計數，記錄8個視野內的微血管數，取平均值。(2)AQP4、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達水平：兩組裸小鼠標本予以3%過氧化氫孵育消除過氧化物酶活性，微波修復10 min，滴加非免疫性血清，室溫孵育20 min后去除血清；滴加AQP4抗體，過夜后利用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫后進行染色，利用3′3二氨基聯苯胺進行顯色反應；采用蘇木精復染，封片后觀察顏色變化(棕黃色為陽性)；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的檢測方法同AQP4(AQPs抗體分別更換為E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體)。

2 結果

2.1 腫瘤重量、MVD觀察組裸小鼠腫瘤重量為(0.41±0.18)g，對照組裸小鼠腫瘤重量為(1.02±0.23)g。觀察組裸小鼠腫瘤重量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.98，P<0.05)。觀察組裸小鼠MVD為(20.1±9.2)條；對照組裸小鼠MVD為(45.2±12.3)條。觀察組裸小鼠MVD低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.38，P<0.05)。兩組裸小鼠腫瘤細胞質量形態(tài)見圖1。

圖1 兩組裸小鼠腫瘤質量

2.2AQP4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達水平 光學顯微鏡下可見裸小鼠腫瘤組織中AQP4、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(見圖2)；觀察組裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表達水平低于對照組，E-cadherin表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin of nude mice between the two groups

組別例數AQP4E-cadherinN-cadherinVimentin對照組300.27±0.030.31±0.020.41±0.040.34±0.03觀察組300.23±0.020.36±0.030.34±0.030.28±0.02t值6.0767.5967.6689.115P值<0.05<0.05<0.05<0.05

注：AQP4=水通道蛋白4，E-cadherin=E-鈣黏著蛋白，N-cadherin=N-鈣黏著蛋白，Vimentin=波形蛋白

注：AQP4=水通道蛋白4，E-cadherin=E-鈣黏著蛋白，N-cadherin=N-鈣黏著蛋白，Vimentin=波形蛋白

圖2 兩組裸小鼠AQP4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達情況(HE染色，×100)

Figure2 Expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin of nude mice of the two groups

3 討論

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率居男性惡性腫瘤之首，嚴重威脅人們生命健康。外科手術是目前治療早期肺癌的主要手段，但患者生存率較低；另外，放化療治療晚期肺癌患者的毒副作用較多，且治療效果欠佳。因此，肺癌的治療仍是臨床亟待解決的難題之一。近年來，隨著肺癌靶向治療的發(fā)展，許多靶點相繼發(fā)現給肺癌患者帶來了福音。

AQPs是一組小分子疏水性的內在膜蛋白家族，存在于動物、植物和微生物的細胞膜上，目前已發(fā)現超過20種亞型，各種亞型均有相似的蛋白結構和高度同源的DNA序列，均具有促進血管增生和增加血管滲透性的作用[4-5]。APQ4由2個重復跨膜域構成，有2個連接環(huán)，且每個鏈接環(huán)包含1個天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸特征性序列，當2個鏈接環(huán)發(fā)生重疊并形成1個孔道時可使1個水分子實現跨膜轉運[6-8]。研究表明，APQ4具備水分子轉運功能，可增強細胞膜水滲透性，促使腫瘤細胞遷移[9]；其敲除可明顯降低星形膠質細胞遷移能力[10]；并在腫瘤細胞生長和血管生成、侵襲及轉移中發(fā)揮著重要作用[11-12]。

本研究結果顯示，觀察組裸小鼠腫瘤重量、MVD低于對照組，與相關研究結果一致[13]，提示APQ4可促進腫瘤細胞增殖和血管生成。研究表明，APQ4可增加腫瘤細胞的擴散能力，N-cadherin和Vimentin有助于提高細胞生長速度和轉移能力，尤其在侵襲性腫瘤中；E-cadherin可保持上皮細胞的正常功能和完整性，抑制腫瘤細胞的轉移和擴散[14]；APQ4在肺癌中的表達水平較高，可促進腫瘤細胞生長和遷移[15]。本研究結果顯示，觀察組裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表達水平低于對照組，E-cadherin表達水平高于對照組，與相關研究結果一致[14]。分析原因可能為本研究觀察組通過抑制APQ4的表達而導致N-cadherin和Vimentin的表達水平降低和E-cadherin表達水平升高，而減緩了腫瘤細胞生長速度。

綜上所述，APQ4在肺癌裸小鼠模型中表達增強，其可能參與了肺癌的病理生理過程，可在一定程度上促進腫瘤細胞增殖與遷移。但本研究未探討APQ4在肺癌遷移中的具體作用機制，仍有待進一步研究完善。

作者貢獻：周永春、張琦、陳婉玲進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；方育、李融林、張璟進行實驗實施、評估、資料收集；周永春進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李潔晨)

ExpressionandImpactonTumorCellProliferationandMigrationofAQP4inNudeMicewithLungCancer

ZHOUYong-chun1，ZHANGQi2，CHENWan-ling3，FANGYu4，LIRong-lin2，ZHANGJing2

1.YunnanProvincialKeyLaboratoryforLungCancer，theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650118，China2.DepartmentofThoracicSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650031，China3.DepartmentofOncology，YunnanProvincialGeneralHospitalofChineseArmedPoliceForce，Kunming650221，China4.DepartmentofAnesthesiology，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650031，China

ObjectiveTo investigate the expression and impact on tumor cell proliferation and migration of AQP4 in nude mice with lung cancer.MethodsThis experiment was carried out in December 2016，in Yunnan Provincial Key Laboratory for Lung Cancer，the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University.A total of 60 SPF-level male nude mice were selected and divided into control group and observation group according to random number table，each of 30 mice.Nude mice of control group

subcutaneous injection of A549 lung cancer cells without infection(0.2 ml)around dorsal axillary tissue to prepare the lung cancer model，while nude mice of observation group received subcutaneous injection of A549 lung cancer cells with AQP4-shRNA infection(0.2 ml)around dorsal axillary tissue to prepare the lung cancer model.Tumor weight，microvessel density，expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin were compared between the two groups.ResultsTumor weight and microvessel density of observation group were statistically significantly lower than those of control group(P<0.05).Expressions of AQP4，N-cadherin and Vimentin of observation group were statistically significantly lower than those of control group，while expression of E-cadherin of observation group was statistically significantly higher than that of control group(P<0.05).ConclusionExpression of APQ4 is higher in nude mice with lung cancer，it may plan a role in the pathophysiological process of lung cancer，can promote the tumor cell proliferation and migration to some extent.

Lung neoplasms；Mice，nude；Aquaporin 4

云南省教育廳科研基金重點項目(2013Z110)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯合專項基金項(2013FB132)；云南省衛(wèi)生科技計劃項目(2014NS001)；云南省應用基礎研究面上項目(2016FB145)

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.08.016

2017-03-10；

2017-08-05)

1.650118云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院云南省肺癌重點實驗室

2.650031云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科

3.650221云南省昆明市，中國人民武裝警察部隊云南省總隊醫(yī)院腫瘤科

4.650031云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科

周永春，張琦，陳琬玲，等.水通道蛋白4在肺癌裸小鼠模型中的表達及其對腫瘤細胞增殖與遷移的影響研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2017，25(8)：69-72.[www.syxnf.net]

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