姚 琴，胡廣斌＃，邢玉平，朱兆香，郭樹林，陳孝仁

（1.江蘇省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司弶港分公司，江蘇東臺224200；2.揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，江蘇揚州225009)

小麥莖基腐病原菌的分離與鑒定

姚 琴1，胡廣斌1＃，邢玉平1，朱兆香1，郭樹林1，陳孝仁2?

（1.江蘇省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司弶港分公司，江蘇東臺224200；2.揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，江蘇揚州225009)

近年來，江蘇沿海地區(qū)小麥普遍出現(xiàn)基部葉鞘腐爛、葉枯等癥狀，造成一定的產(chǎn)量損失。為明確病原菌，對病株進行組織分離得到1株真菌。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定為微結(jié)節(jié)霉屬真菌（Microdochiumnivale）。利用PCR技術(shù)對病原菌的核糖體間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)域(ITS)序列進行擴增，測序比對發(fā)現(xiàn)與M.nivale的同源相似性為99%。經(jīng)致病性測定，確定M.nivale為引起小麥基部葉鞘腐爛、葉枯等癥狀的病原菌，結(jié)合先前報道稱之為雪腐葉枯病。

小麥；鞘腐；雪腐葉枯??；ITS；致病性

姚琴,胡廣斌,邢玉平,朱兆香,郭樹林,陳孝仁.小麥莖基腐病原菌的分離與鑒定[J/OL].大麥與谷類科學(xué),2017,34(4):40-44 [2017-07-22].http://kns.cnki.net/kcms/detail/32.1769.S.20170722.1827.001.html.

近年來，由于大面積推廣秸稈還田，一些腐生性的病原菌在田間不斷地積累，導(dǎo)致后茬作物病害發(fā)生較為嚴重。小麥莖基腐病在江蘇、河南等地相繼報道，發(fā)生面積不斷擴大，給小麥的生產(chǎn)帶來一定威脅[1-4]。小麥莖基腐病是幾種病害的統(tǒng)稱，且各地報道的病原物存在一定的差異[1-4]。李偉等認為根腐離蠕孢是小麥莖基腐病的主要病原菌[2]；張向向等認為Fusarium asiaticum和Fusarium graminearum為小麥莖基腐病的主要病原物[3]。病原物的不同導(dǎo)致防治措施上也存在一定的差異。此外，小麥全蝕病、小麥紋枯病等病害早期癥狀與小麥莖基腐病非常類似，難以區(qū)分，易誤判而耽誤最佳防治時期[5]。本研究對江蘇弶港農(nóng)場小麥莖基部葉鞘腐爛等癥狀的病原菌進行分離，首次利用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法，將核糖體 DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed space，ITS）作為一種遺傳標(biāo)記，對病原菌的種進行鑒定，為制定小麥莖基腐病有效的防治措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥莖基腐病原菌分離和純化

發(fā)病小麥取自于江蘇弶港農(nóng)場小麥田。于小麥基部葉鞘病健交界處切取若干5 mm2的組織塊，用漂白粉消毒后，按常規(guī)的組織分離法進行分離培養(yǎng)。采用單孢分離法純化菌株。

1.2 小麥莖基腐病原菌鑒定

菌株接種到PDA平板上，置25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，記錄生長速率，觀察形態(tài)特征。在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)加入5 mL無菌水，挑入少許氣生菌絲于無菌水中，25℃下培養(yǎng)3～5 d后，觀察是否有厚垣孢子產(chǎn)生[6]。菌株接種至液體PDA培養(yǎng)基，25℃、150 r/min培養(yǎng)3d后收集菌絲，利用吸水紙擠干水分，采用CTAB法提取DNA。采用引物ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3＇)和ITS5(5＇-GGAAGTAAAAGTCGT AACA AGG-3＇)擴增真菌核糖體DNA的ITS1-5. 8S rRNA-ITS2片段。PCR擴增體系 (20 μL)：10× PCRBuffer 2 μL，模板DNA 100～300 ng，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.2 μL，dNTPs (2.5 mmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶 (5 U/μL)0.2 μL，ddH2O補齊到20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，進行30個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，通過膠回收試劑盒(AXYGENAxyPrep DNA Gel Extraction Kit，杭州愛思進公司)純化回收后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，送上海生物工程有限公司測序。測序結(jié)果提交至NCBI進行比對分析。

1.3 病原菌致病力測定

致病力測定采用培養(yǎng)皿幼苗直接接種培養(yǎng)法[7]。小麥種子在培養(yǎng)皿中利用濾紙保濕培養(yǎng)，出芽7 d后，將孢子懸浮液(105個/mL)直接接種于培養(yǎng)皿中，保持菌液浸沒種子24 h，接種后保濕48 h，以后只澆清水，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察發(fā)展情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥莖基腐病癥的田間調(diào)查

2016年對江蘇省弶港農(nóng)場小麥基部病害進行調(diào)查。小麥莖基腐病癥在該地區(qū)田間發(fā)生普遍，2月份調(diào)查發(fā)現(xiàn)田間病株率在30%左右，部分田塊高達80%。該地區(qū)田間典型癥狀為初期基部葉鞘為黃褐色，隨著病害的發(fā)展葉鞘顏色逐漸加深至深褐色，致使葉鞘及與之相連的整個葉片壞死(圖1A)。小麥拔節(jié)后，病害往上部葉鞘發(fā)展，病株基部第1至2節(jié)間的葉鞘變褐、腐爛，隨之導(dǎo)致相連葉片枯死(圖1B)。小麥孕穗期，在病株基部壞死的葉鞘上能夠觀察到黑色的子囊殼(圖1B)，在群體密度大、濕度高的情況下，小麥基部葉鞘及莖稈上出現(xiàn)粉紅色的霉層(圖1B、圖1C)。感病植株生長衰弱，導(dǎo)致小麥上部功能葉早衰，影響千粒質(zhì)量，嚴重植株基部壞死導(dǎo)致枯白穗。感病小麥根系不發(fā)達，基部莖稈易折，灌漿后易發(fā)生倒伏現(xiàn)象(圖1D)。

圖1 小麥莖基腐病田間癥狀

2.2 小麥莖基腐病原菌分離菌株的形態(tài)鑒定

利用組織分離法，從病株上分離到1個菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生白色的絮狀氣生菌絲，培養(yǎng)基背面為淡橘紅色，經(jīng)測量其在25℃、PDA培養(yǎng)基上生長速率為1.07 cm/d(圖2A、圖2B)。培養(yǎng)25 d左右能夠在平板上產(chǎn)生肉眼可見的橘紅色粘分生孢子團(25℃)。研究表明，低溫有助于該病原菌分生孢子的產(chǎn)生，故待菌絲長滿平板后，將培養(yǎng)皿放入4℃環(huán)境下，能夠使得分生孢子產(chǎn)生時間提前5 d左右。分生孢子呈鐮刀狀，平均大小為20.1 μm×4.31 μm，1～3個隔膜，其中以一個隔膜居多，達90%以上(圖2C)。對田間采集的子囊殼進行鏡檢，能夠發(fā)現(xiàn)子囊及子囊孢子(圖2D、圖2E)。子囊殼近橢圓形，平均大小188.47μm×162.11μm，內(nèi)生子囊孢子呈柱狀（58.03 μm×6.57 μm），子囊孢子大小13.82 μm×4.63 μm。此外，菌絲在無菌水中培養(yǎng)5d后未能觀察到厚垣孢子。綜合上述特征，初步鑒定該病原菌為微結(jié)節(jié)霉屬真菌（Microdochiumnivale）。

圖2 分離菌珠的形態(tài)特征

2.3 小麥莖基腐病原菌分離菌株的分子鑒定

為進一步確認形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，利用真菌通用引物ITS4和ITS5組合擴增病原菌核糖體DNA的ITS1-5.8S rRNA-ITS2片段。PCR產(chǎn)物電泳檢測條帶特異，測序分析片段全長為581 bp。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性分析比對，結(jié)果表明菌株與M.nivale同源相似性為99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌為M.nivale。

圖3 ITS序列同源比對結(jié)果

2.4 小麥莖基腐病原菌分離菌株的致病性測定

致病性測定表明，M.nivale室內(nèi)接種引起的癥狀與田間基本一致。在接種早期(接種后10 d左右)能夠?qū)е滦←溁咳~鞘變褐(圖4B)，隨著接種時間延長，逐漸向葉片發(fā)展，導(dǎo)致葉片枯黃并且死亡(圖4C)，接種植株發(fā)病率高達100%。對照在觀察的時間段內(nèi)均未出現(xiàn)上述癥狀。與對照相比，萌動種子受侵染顏色加深、腐爛，種子根也呈黑褐色(圖4B、圖4C)。進一步通過科赫氏法則確定，引起該地區(qū)小麥基部葉鞘腐爛的病原菌為M.nivale。并結(jié)合國外相關(guān)報道[12-13]，將所致病癥定為小麥雪腐葉枯病。

圖4 M.nivale室內(nèi)接種小麥癥狀

3 結(jié)論與討論

綜上所述，本研究將小麥莖基腐病病原菌鑒定為M.nivale，而M.nivale是一種世界范圍內(nèi)廣泛分布的、具有重要經(jīng)濟價值的植物病源真菌。M. nivale寄主范圍廣泛，主要危害小麥、大麥、燕麥、黑麥、草坪草及牧草等禾本科作物[8]。M.nivale早期被稱為Fusarium nivale，1980年Gams等認為其與鐮刀菌存在較大的差異而將其命名為Gerlachia nivale[9]。隨著分類研究的進展，Samuels等在1983年將其劃分至微結(jié)節(jié)霉屬(Microdochium)中并命名為M.nivale，一直沿用至今[10]。M.nivale在小麥苗期能夠引起2種重要的病害，即紅色雪腐病和雪腐葉枯病。紅色雪腐病主要發(fā)生在北歐、加拿大以及我國新疆北部和黑龍江冬麥區(qū)等冬季氣溫低、積雪時間長且積雪厚的地區(qū)[5，8，11]，作物被侵染后死亡率很高，常常需要重新補種；在溫度較高地區(qū)，M.nivale導(dǎo)致小麥基部葉鞘腐爛、葉枯等癥狀，稱為雪腐葉枯病[12-13]。

商鴻生等報道雪腐葉枯病在小麥葉片典型癥狀為橢圓形的大斑，直徑2～3 cm[5,14-16]。本次調(diào)查未能發(fā)現(xiàn)該類葉斑，可能與小麥品種及病原菌差異所致。李偉等先前在江蘇地區(qū)分離到M.nivale，致病性測定其致病力較弱[2]。本研究中，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)由M.nivale引起鞘腐等癥狀發(fā)病率普遍在30%左右，嚴重者后期能夠蔓延至中部葉鞘，導(dǎo)致小麥早衰，千粒質(zhì)量及產(chǎn)量嚴重下降；室內(nèi)致病性測定發(fā)現(xiàn)其致病率高達100%，為該地區(qū)重要的致病菌。Snider等人研究發(fā)現(xiàn)M.nivale最適生長溫度在10℃左右，零下5℃仍然活躍[17]。本研究室內(nèi)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，M. nivale在低溫環(huán)境下更易產(chǎn)生分生孢子，利于病害的發(fā)展。由此，田間病害調(diào)查與防治應(yīng)立足早春，以防止病害進一步擴展。M.nivale同時也是小麥赤霉病的病原菌之一，在小麥抽穗揚花期間能夠侵染穗部導(dǎo)致枯白穗；小麥?zhǔn)斋@后，遇潮濕氣候能夠在麥粒上腐生產(chǎn)生毒素，降低小麥品質(zhì)[13,18-19]。下一步研究將關(guān)注該病害的防治，篩選出高效防治藥劑，以期為江蘇省乃至全國小麥雪腐葉枯病的防治工作提供技術(shù)指導(dǎo)。

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Isolation and Identification of the Pathogenic Fungus Causing Root and Crown Rot of Wheat

YAO Qin1,HU Guang-bin1＃,XING Yu-ping1,ZHU Zhao-xiang1,GUO Shu-lin1,CHEN Xiao-ren2
(1.JianggangBranch ofJiangsu ProvincialAgriculturalReclamation and DevelopmentCo.,Ltd.,Dongtai224200,China; 2.College ofHorticulture and PlantProtection,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

In recent years,wheat grown in Jiangsu coastal areas developed disease symptoms manifested by decaying leaf sheaths and withered leaves,resulting in a certain degree of yield loss.A fungal isolate was obtained from diseased wheat tissues.Based on its morphological features,the fungal isolate was initially identified asMicrodochiumnivale.Its internal transcribed space (ITS)was amplified through PCR and subsequently sequenced.The comparison between its ITS sequence and that ofM.nivalerevealed that they have 99%homology.Furthermore,the isolatedM.nivaledemonstrated the ability to cause wheat sheath rot and leaf blight in the assay of pathogenicity determination.Taken together,the above results confirm that the pathogenic fungus causing root and crown rot of wheat isM.nivale.Based on the results in this study as well as previous reports,the disease caused by this pathogen is found to be snow mold disease.

Wheat;Leaf sheath rot;Gerlachia leaf blight;ITS;Pathogenicity determination

S432.1

A

1673-6486-20170323

2017-02-18

姚 琴（1989—），女，碩士研究生，主要從事病蟲測報及防治工作。E-mail:1032352530@qq.com。

＃共同第一作者：胡廣斌（1969—），男，高級農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)術(shù)管理與推廣。E-mail:531253569@qq.com。

?通訊作者：陳孝仁（1978—），男，博士，副教授，主要從事真菌病害研究。E-mail:31322926@qq.com。