李 敏 高 毅穆春暉 王彥敏都廣艷李立芳 楊夢(mèng)華（河北省中醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 0500）

實(shí)驗(yàn)研究

補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞骨鈣素合成的影響

李 敏 高 毅△穆春暉 王彥敏1都廣艷2李立芳 楊夢(mèng)華
（河北省中醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050011）

目的 觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞（MC3T3－E1細(xì)胞）骨鈣素（OCN）合成的影響。方法 用10%補(bǔ)腎活血固齒方含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清分別培養(yǎng)MC3T3－E1細(xì)胞24 h、48 h、72 h，125Ⅰ放射免疫法檢測(cè)3組細(xì)胞上清液中OCN的含量。結(jié)果 含藥血清組24、48、72 h OCN含量與無(wú)藥血清組、胎牛血清組同期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），含藥血清組24、48、72 h OCN含量顯著高于無(wú)藥血清組、胎牛血清組同期。結(jié)論 補(bǔ)腎活血固齒方可提高M(jìn)C3T3－E1細(xì)胞分泌OCN的水平，促進(jìn)該細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，加速骨的形成。

成骨細(xì)胞；小鼠；骨鈣素；牙周炎；中藥療法

牙周炎是發(fā)生在牙周組織的疾病，可導(dǎo)致成年人牙齒的喪失，其不但危害口腔健康，而且與全身健康及全身疾病存在雙向的密切關(guān)聯(lián)［1］。河北省中醫(yī)院口腔科應(yīng)用補(bǔ)腎活血固齒方治療牙周炎臨床療效較好，但其作用機(jī)制不甚明確。前期實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)顱頂前成骨細(xì)胞（MC3T3－E1細(xì)胞）增殖及細(xì)胞周期均無(wú)明顯影響［2］。其是否通過(guò)促進(jìn)MC3T3－E1細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)牙槽骨的再生有待研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用補(bǔ)腎活血固齒方含藥血清作用于MC3T3－E1細(xì)胞，觀察其對(duì)骨鈣素（osteocalcin，OCN）分泌的影響，探討該方劑治療牙周炎的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 α－最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基（α－MEM），β－巰基乙醇（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司），肌醇（北京索萊寶科技股份有限公司），葉酸（Amresco），胰酶（Amresco），乙二胺四乙酸（EDTA）（天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)公司），戊巴比妥（華北制藥股份有限公司），胎牛血清（PAA Laboraties GmbH），125Ⅰ骨鈣素放免分析盒（晶賽生物技術(shù)公司）。

BSC－1100ⅡA2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），HF240二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），TE2000－U熒光倒置顯微鏡（NiKon），B40型醫(yī)用低速離心機(jī)（安新縣白洋離心機(jī)廠），D－37520高速離心機(jī)（Thermo ELECTRON CORPORATION），HKAA2450－230精密電子天平（BEL Engineering），水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市江南儀器廠），GC－1200γ放射免疫計(jì)數(shù)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD系大鼠20只，體質(zhì)量280～300 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)1312020。飼養(yǎng)條件室溫保持在18～25℃，空氣流通，12 h維持光照，動(dòng)物在籠中自由攝食飲水。飼料由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 MC3T3－E1細(xì)胞培養(yǎng) 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)的MC3T3－E1細(xì)胞，將原培養(yǎng)液吸去，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2遍，加1 mL 0.25%胰酶，于37℃下消化1 min，加入1.5 mLα－MEM培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞，使其充分懸浮，而后移到15 mL離心管中，1 000 r／min離心5 min后將上清液吸去，加入4.5 mLα－MEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，使位于管底的細(xì)胞均勻分散懸浮。再取3個(gè)培養(yǎng)瓶，向每個(gè)瓶中滴入1.5 mL細(xì)胞懸液，而后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每隔2 d換液1次。培養(yǎng)5～6 d，細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底70～80%時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.4 中藥制備 補(bǔ)腎活血固齒方藥物組成：淫羊藿15 g，補(bǔ)骨脂15 g，熟地黃10 g，當(dāng)歸10 g，丹參10 g，知母10 g，甘草3 g。藥劑制備：藥物加10倍量蒸餾水煎煮1.5 h，過(guò)濾；加同量蒸餾水重煎1.5 h，過(guò)濾。合并濾液濃縮至150 mL，裝袋備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及血清制備 20只大鼠隨機(jī)分為2組，無(wú)藥血清組10只，含藥血清組10只。含藥血清組按體表面積的方法折算人體等效劑量，按4.875 g生藥／kg體質(zhì)量計(jì)算用藥量，每日灌胃2次，連續(xù)灌胃7 d，最后1 d第2次灌胃后間隔2 h再次灌胃，于末次給藥后1 h，1.2%戊巴比妥麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血。每只大鼠的血液置于不同離心管中，冷置1 h后，3 000 r／min離心20 min，將同組各只大鼠離心管中的上清液置于同一離心管中混合以減少不同大鼠的個(gè)體差異，56℃滅活30 min，濾菌器抽濾除菌后分裝，－20℃保存?zhèn)溆?。胎牛血清組、無(wú)藥血清組大鼠等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，血清制備方法同前。血清直接購(gòu)買(mǎi)自PAALa boraties GmbH。

1.6125Ⅰ放射免疫法檢測(cè)MC3T3－E1細(xì)胞上清液中OCN含量 用0.25%胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3－E1細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，取3塊24孔板每孔接種MC3T3－E1細(xì)胞15 000個(gè)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)2 d后，3塊板分別換用10%含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清培基培養(yǎng)細(xì)胞，每塊24孔板每組血清均設(shè)8個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)24、48、72 min各拿出一塊24孔板，吸出培基，分別將其加入微量離心管（eppendorf，EP管）中，1 000 r／min離心5 min。吸取每個(gè)EP管中的上清液分別移入新的EP管，再次離心，再次吸取每個(gè)EP管中的上清液分別移入新的EP管進(jìn)行OCN測(cè)定。嚴(yán)格依據(jù)骨鈣素放免試劑盒說(shuō)明操作，每個(gè)樣品中加入100μL125Ⅰ－OCN，100μL OCN抗體，充分搖勻后，4℃靜置24 h，加入分離試劑500μL，充分搖勻后，4℃放置20 min，3 500 r／min離心25 min，棄上清后，上機(jī)測(cè)沉淀物的每min計(jì)數(shù)值，按照標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)得到樣品OCN含量，結(jié)果以ng／mL表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx ±s）表示，多組的組間比較采用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

3組血清中OCN含量比較見(jiàn)表1。

表1 3組血清中OCN含量比較 n＝8，ng／m L，ˉx±s

由表1可見(jiàn)，24、48、72 h時(shí)含藥血清組OCN含量顯著高于無(wú)藥血清組及胎牛血清組同期，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；無(wú)藥血清組與胎牛血清組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），含量相當(dāng)。含藥血清組組內(nèi)數(shù)據(jù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OCN水平增加，藥物作用顯示出具有時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。

3 討 論

牙周炎是口腔科第二大疾病，其發(fā)病機(jī)制是致病因素導(dǎo)致牙周膜內(nèi)的膠原破壞，結(jié)合上皮向根方增殖，牙齦生理附著被破壞，牙齦溝加深，形成牙周袋，炎癥繼續(xù)向深部發(fā)展，致使牙槽骨破壞吸收最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落。牙周炎除了導(dǎo)致成年人牙齒喪失外，還可誘發(fā)全身性疾病，危害人類(lèi)健康。治療牙周炎的關(guān)鍵是阻止牙槽骨破壞吸收或促進(jìn)牙槽骨的再生，而牙槽骨的代謝依賴(lài)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡而起調(diào)節(jié)作用。

牙周炎屬中醫(yī)學(xué)“牙宣”“齒豁”范疇。中醫(yī)病機(jī)為脾胃濕熱、氣血不足、腎精虧損［3］。李敏等［4］將180例慢性牙周炎患者隨機(jī)分為2組，治療組120例，對(duì)照組60例。對(duì)照組行牙周基礎(chǔ)治療（全口潔治、齦下刮治術(shù)）；治療組在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上辨證為脾胃濕熱型、氣血不足型、腎精虧損型3型治療。結(jié)果：治療組總有效率97%，對(duì)照組總有效率60%，治療組療效優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。補(bǔ)腎活血固齒方以“腎主骨”理論為基礎(chǔ)，方中淫羊藿、補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽(yáng)，強(qiáng)筋壯骨；熟地黃、當(dāng)歸、丹參補(bǔ)血活血，填精益髓；知母清熱瀉火，滋陰潤(rùn)燥；甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。其中淫羊藿是一種傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥，經(jīng)常被用于治療骨質(zhì)疏松癥。實(shí)驗(yàn)證實(shí)其主要成分淫羊藿苷體外可以增加成骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)骨形成，抑制破骨細(xì)胞的分化［5－6］。

目前用于體外實(shí)驗(yàn)研究的成骨細(xì)胞有2個(gè)主要來(lái)源：原代分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞株。原代細(xì)胞取材于活體組織，其優(yōu)點(diǎn)是取材的組織、細(xì)胞離體時(shí)間短，生物學(xué)形狀發(fā)生變化小，在一定程度上反映了體內(nèi)狀態(tài)，其缺點(diǎn)是受到取材和培養(yǎng)條件等諸多因素的干擾，會(huì)影響細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)特性，不同批次取得的原代細(xì)胞穩(wěn)定性差［7］。該實(shí)驗(yàn)采用的MC3T3－E1細(xì)胞是日本學(xué)者Kadama等1981年從新生C57BL／6小鼠顱頂骨細(xì)胞中建株的成骨細(xì)胞系，與原代培養(yǎng)顱頂成骨細(xì)胞具有類(lèi)似的生物學(xué)特性，其增殖穩(wěn)定，可無(wú)限傳代，常用作研究體外成骨細(xì)胞分化及骨代謝的細(xì)胞模型［8］。MC3T3－E1細(xì)胞系包括4、14、24和30 4種亞型，本研究選用的亞克隆14（MC3T3－subclone14）為該細(xì)胞系中的高分化亞克隆型，與原代培養(yǎng)的顱頂成骨細(xì)胞的生物行為類(lèi)似，是研究體外成骨細(xì)胞分化模型的較好選擇。高毅等［9］通過(guò)研究補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠MC3T3－E1細(xì)胞堿性磷酸酶（Alkaline Phosphosphatase，ALP）活性的影響，探討該方劑成骨的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中用10%含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清分別培養(yǎng)MC3T3－E1細(xì)胞24、48、72 h，檢測(cè)MC3T3－E1細(xì)胞中ALP的活性，觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3－E1細(xì)胞分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含藥血清組MC3T3－E1細(xì)胞中ALP活性顯著高于胎牛血清組、無(wú)藥血清組，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物作用效果顯示時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)認(rèn)為補(bǔ)腎活血固齒方可時(shí)間依賴(lài)性增強(qiáng)MC3T3－E1細(xì)胞中ALP活性，促進(jìn)MC3T3－E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。

“血清藥理學(xué)”是日本學(xué)者田代真一于1988年提出的，是給予動(dòng)物灌服中藥或中藥復(fù)方一定時(shí)間后，采集、分離動(dòng)物血清，再用含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種方法［10］。此種方法不僅具有體外實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，避免了中藥粗提物的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)藥物的體內(nèi)效應(yīng)的不客觀及不確切性，含藥血清能更好地反映藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程，在理論上更具科學(xué)性和真實(shí)性。而且該方法操作簡(jiǎn)單，可控性強(qiáng)，重復(fù)性好，費(fèi)用低廉［11］。該方法的缺點(diǎn)是還不能完全替代在體動(dòng)物的中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法，另外為了取得穩(wěn)定的血藥濃度，需要每隔1個(gè)半衰期給藥1次，連續(xù)給4～6個(gè)半衰期，以達(dá)到最大血藥濃度，因中藥復(fù)方成分復(fù)雜，半衰期很難測(cè)定，所以灌胃7～10 d是常規(guī)的給藥方案［12］。血清中含有多種生物活性物質(zhì)，對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生一定影響，干擾客觀評(píng)價(jià)藥物療效。有學(xué)者提出含藥血清應(yīng)該經(jīng)56℃水浴30 min滅活，滅活后的血清其正常生物活性基本喪失，突出血清中中藥有效成分的作用，并最大程度地減少微生物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的感染［12］。穆春暉等［13］應(yīng)用血清藥理學(xué)的方法，將含藥血清加入培基中檢測(cè)MC3T3－E1細(xì)胞的指標(biāo)變化以評(píng)估中藥方劑對(duì)前成骨細(xì)胞的作用，應(yīng)用未滅活的無(wú)藥血清及含藥血清培育MC3T3－E1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞經(jīng)上述血清孵育12 h后，大量細(xì)胞出現(xiàn)偽足收縮，由多角形變成球形并漂浮死亡，認(rèn)為出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是未經(jīng)滅活的血清中含有補(bǔ)體等大量生物活性物質(zhì)，干擾細(xì)胞正常生長(zhǎng)造成死亡。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，使用經(jīng)滅活后的血清孵育細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)正常。

成骨細(xì)胞分化晚期，即成骨細(xì)胞進(jìn)入礦化期時(shí)，與細(xì)胞外基質(zhì)中羥磷灰石沉積相關(guān)的基因如OCN等表達(dá)達(dá)到高峰。OCN又被稱(chēng)為γ－羧基谷氨酸蛋白或骨依賴(lài)維生素K蛋白，是成骨細(xì)胞特異合成和分泌的一種非膠原骨蛋白。其生理功能是保持骨的正常礦化，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的主要指標(biāo)之一［14－15］，也是骨形成或骨轉(zhuǎn)換的重要標(biāo)志。羧基化后的OCN與細(xì)胞外基質(zhì)中的鈣、磷結(jié)合，而后沿膠原分子的長(zhǎng)軸，鈣和磷結(jié)合到膠原分子的側(cè)鏈上的膠原氨基酸殘基上，形成羥磷灰石結(jié)晶，使骨礦化。因此，本實(shí)驗(yàn)以O(shè)CN含量為指標(biāo)，檢測(cè)補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3－E1細(xì)胞分化、成熟的影響。本實(shí)驗(yàn)用含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)MC3T3－E1細(xì)胞，檢測(cè)24、48、72 h細(xì)胞上清液中OCN的含量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，24、48、72 h含藥血清組OCN含量顯著高于無(wú)藥血清組及胎牛血清組同期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OCN水平增加，藥物作用效果顯示出時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。結(jié)果提示補(bǔ)腎活血固齒方可提高M(jìn)C3T3－E1細(xì)胞分泌OCN的水平，促進(jìn)該細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)牙槽骨的再生而發(fā)揮其治療牙周炎的藥物作用。

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Effects of Bushen－h(huán)uoxue－guchi formula on the synthesis of OCN of pre－osteoblasts in m ice calvarium

LI Min*，GAO Yi，MU Chunhui，et al．*
Department of Stomatology，Hospital of Traditional Chinese Medicine in Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang 050011

Objective To observe the effects of Bushen－h(huán)uoxue－guchi formula on the synthesis of osteocalcin（OCN）of pre－osteoblasts inmice calvarium（MC3T3－E1 cells）.M ethods MC3T3－E1 cellswere cultured respectively for 24 h，48 h and 72 h by serum containing drug of10%Bushen－h(huán)uoxue－guchi formula，drug free serum and fetal bovine serum（FBS），and the contents of OCN in 3 groupswere tested by125I radioimmunoassay.Results Therewere statistical differences on the contentofOCN among the serum containing drug group，drug free serum and FBS group at the same period（24 h，48 h and 72 h）（P＜0.05），and which in serum containing drug group were higher than those in the drug free serum group and fetal bovine serum group at the same period（24 h，48 h and 72 h）（P＜0.05）.Conclusion Bushen－h(huán)uoxue－guchi formula can improve the level of MC3T3－E1 cells secreting OCN，promote the differentiation of the cells into osteoblasts and accelerate the formation of bone.

Osteoblasts；Rat；OCN；Periodontitis； Traditional Chinesemedicine therapy

R－332；R341.3；R977.6；R781.42

A

1002－2619（2017）08－1226－04

2017－01－04）

（本文編輯：董軍杰）

10．3969／j．issn．1002－2619．2017．08．027

△通訊作者：河北省中醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050011

1 河北省石家莊市第三醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050011

2 石家莊市醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校口腔醫(yī)學(xué)教研室，河北 石家莊050010

李敏（1979—），女，主治醫(yī)師，碩士。從事口腔內(nèi)科疾病的臨床研究