王恩雨，高晶，郭東華，李春秋，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

豬整合素αv多克隆抗體制備與應(yīng)用

王恩雨，高晶，郭東華，李春秋，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)豬整合素αv基因片段進(jìn)行表達(dá)，純化目的蛋白免疫小鼠，制備豬整合素αv多克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行鑒定及初步應(yīng)用。對(duì)基因序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析后，截取胞外區(qū)抗原性較好的基因片段，針對(duì)大腸桿菌稀有密碼子優(yōu)化后合成該基因序列，克隆至pGEX-6p-1原核表達(dá)載體上，誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組蛋白，對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western blot鑒定后免疫小鼠，制備多克隆抗體。利用間接ELISIA方法檢測(cè)抗體效價(jià)，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)豬整合素αv多克隆抗體與天然整合素αv蛋白的反應(yīng)原性。獲得了分子質(zhì)量為83 ku的重組蛋白，以純化的重組蛋白作為免疫原制備的多克隆抗體效價(jià)大于1∶6 400，且能識(shí)別天然整合素αv蛋白。研究成功制備了豬整合素αv多克隆抗體，為后續(xù)相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

豬；整合素αv；多克隆抗體；重組蛋白；病毒受體

整合素是一類細(xì)胞表面蛋白由α和β亞基組成，α亞基和β亞基可以形成多種異源二聚體。α亞基中aD，aE，aL，aM，aX，a1，a2，a10，a11包含I結(jié)構(gòu)域，通常它們的I結(jié)構(gòu)域是配基結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)α亞基不含I結(jié)構(gòu)域時(shí)，如a3，a4，a5，a6，a7，a8，a9，av和aIIb，這些亞基的配基結(jié)合位點(diǎn)通常為β-螺旋區(qū)，并且和β亞基的I結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起[1]，形成細(xì)胞外配體結(jié)合位點(diǎn)，它們可以識(shí)別配體上特定的氨基酸序列，多數(shù)為RGD序列。大量研究證實(shí)，多數(shù)病毒可利用整合素作為病毒受體或共受體，如人免疫缺陷病毒[2]、腺病毒[3]、漢坦病毒[4]、輪狀病毒[5]、埃博拉病毒等[6]、口蹄疫病毒[7]。在病毒感染過(guò)程中，單獨(dú)的β亞基不能發(fā)揮功能或者功能降低，需要α亞基與β亞基結(jié)合，促使β亞基發(fā)揮生理功能，整合素αv即是其中之一，如αvβ3能增強(qiáng)輪狀病毒侵入細(xì)胞作用，αvβ6是口蹄疫病毒的共受體[8]。因此，整合素αv在介導(dǎo)病毒感染中起到重要的輔助作用。豬整合素αv在豬的腎、氣管上皮、食管、甲狀腺等組織中均有分布[9]，而豬整合素αv在介導(dǎo)病毒侵入方面研究甚少，因此，研究旨在制備豬整合素αv多克隆抗體為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與試驗(yàn)動(dòng)物

E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、pGEX-6p-1原核表達(dá)載體于本實(shí)驗(yàn)室保存；8周齡的Balb/c雌性小鼠購(gòu)，自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；IPTG，購(gòu)自Biosharp公司；T4 DNA Ligase、XhoI和BamHI限制性內(nèi)切酶、ExTaq DNA聚合酶，購(gòu)自Fermentas公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IRDye700DX羊抗鼠IgG，購(gòu)自Li-COR公司；ECL發(fā)光液試劑，購(gòu)自Biotopped公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 合成基因與引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中豬整合素αv的核苷酸序列（GenBank accession no.EF474019），利用CBS網(wǎng)站（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線分析該氨基酸序列的疏水性，截取具有親水性的胞外區(qū)氨基酸序列，通過(guò)DNAStar軟件分析預(yù)測(cè)該氨基酸序列的主要抗原區(qū)，然后截取具有較好抗原性的部分氨基酸序列，優(yōu)化針對(duì)大腸桿菌具有偏嗜性的密碼子，分別在5'和3'末端加入BamHⅠ和XhoⅠ兩種酶切位點(diǎn)，人工合成了αv基因的核苷酸序列。將合成的基因連接至pGH載體上，該合成質(zhì)粒pGH-αv由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物（表1）。

表1 豬整合素αv基因擴(kuò)增引物Table 1Primers for the amplification of porcine integrin αv

1.3 目的蛋白表達(dá)與純化

對(duì)合成質(zhì)粒pGH-αv和pGEX-6p-1載體分別進(jìn)行BamHI和XhoI雙酶切，酶切后目的片段利用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，然后將兩片段利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，并將其轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。隨機(jī)挑取十個(gè)單菌落，利用上述引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，將篩選出的陽(yáng)性菌提取質(zhì)粒備用。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基（100 μg·mL-1Amp+）中培養(yǎng)，當(dāng)OD600的值達(dá)到0.6時(shí)，用IPTG（1 mmol·L-1）誘導(dǎo)4 h，然后利用SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白的表達(dá)。用預(yù)冷的0.1 mmol·L-1KCl浸泡膠至條帶呈乳白色，然后將含有目的蛋白的凝膠切下，裝入含有1×電泳液的透析柱中，100 V洗脫1 h，獲得純化的目的蛋白。

1.4 重組蛋白的抗原性分析

將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜（NC膜）上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h。以GST單克隆抗體（mAb）為一抗（1∶3 000），孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min，以山羊抗鼠HRP-IgG為二抗（1∶2 000）孵育1 h，PBST洗3次，每次10 min，將NC膜置于Super ECL Plus超敏發(fā)光液中，用掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.5 重組蛋白抗體的制備

將純化后蛋白按照一定比例與弗氏佐劑等體積混合，充分乳化后，按50 g/只的劑量于皮下、腹腔多點(diǎn)注射。首次免疫用弗氏完全佐劑，二免和三免用弗氏不完全佐劑，對(duì)照組為健康小白鼠。每次免疫間隔14 d，三免三日后進(jìn)行眼球采血，獲得血清。

1.6 重組蛋白抗體效價(jià)檢測(cè)

以終濃度為1 μg·mL-1的重組蛋白包被96孔板，每孔100 μL，4℃包被過(guò)夜，用5%的脫脂乳37℃封閉2 h，以待測(cè)血清為一抗，并利用用方陣法確定血清稀釋度，以非免疫健康小鼠血清為陰性對(duì)照，37℃孵育2 h，以山羊抗鼠HRP-IgG為二抗，37℃孵育2 h，洗滌后進(jìn)行TMB顯色，避光顯色10 min后加2 mol·L-1H2SO4終止。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的吸光度值。

1.7 重組蛋白抗體的Western blot鑒定

利用含有天然整合素αv蛋白的豬睪丸細(xì)胞（ST細(xì)胞）、豬腎細(xì)胞（PK15細(xì)胞）、豬小腸黏膜上皮細(xì)胞（IEC細(xì)胞）及仔豬小腸組織，分別提取細(xì)胞總蛋白，樣品處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%的脫脂乳室溫封閉2 h。用制備的豬整合素αv多克隆抗體作為一抗（1∶200），室溫孵育2 h。以IRDye700DX羊抗鼠IgG為二抗（1∶5 000），孵育1 h，PBST洗膜30 min。采用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)采集圖像，進(jìn)一步驗(yàn)證制備的豬整合素αv多克隆抗體是否與天然整合素αv蛋白具有反應(yīng)原性。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)及純化結(jié)果

利用CBS網(wǎng)站對(duì)豬整合素αv胞外區(qū)進(jìn)行分析，通過(guò)DNAStar軟件分析豬整合素αv胞外區(qū)的主要抗原區(qū)，進(jìn)一步利用原核表達(dá)載體pGEX-6p-1對(duì)豬整合素αv胞外區(qū)主要抗原區(qū)進(jìn)行表達(dá)與純化。結(jié)果表明，豬整合素αv胞外區(qū)第37～557位氨基酸具有較好的抗原性，該基因經(jīng)密碼子優(yōu)化合成后，克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1。重組質(zhì)粒pGH-αv用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切，獲得了2 907 bp和1 587 bp兩個(gè)片段，與預(yù)期大小相符（圖1）。重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-αv菌液以IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDSPAGE電泳分析，在83 ku處可見(jiàn)特異性的表達(dá)條帶，與預(yù)期條帶大小一致。表達(dá)的細(xì)菌超聲破碎后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示目的蛋白存在于沉淀中，表明蛋白以包涵體的形式存在。通過(guò)切膠純化，獲得了純化蛋白（圖2）。

圖1 豬整合素αv合成質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1Enzyme digestion of porcine integrin αv synthetic plasmid

圖2 重組蛋白表達(dá)和純化結(jié)果Fig.2The result of expression and purification of recombination protein

2.2 重組蛋白的抗原性分析

純化后的重組蛋白經(jīng)Western blot方法分析，以鼠源GST單克隆抗體（mAb）為一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG為二抗，在重組蛋白及標(biāo)簽蛋白大小位置分別有特異性條帶，明確獲得的純化蛋白為目的蛋白（圖3）。

圖3 純化蛋白Western blot鑒定結(jié)果Fig.3The purified protein Western blot identification

2.3 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)

將重組蛋白倍比稀釋后包被96孔板，以不同稀釋倍數(shù)的小鼠血清為一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG為二抗，用間接ELISIA方法檢測(cè)制備的多克隆抗體效價(jià)大于1∶6 400。

2.4 抗體鑒定結(jié)果

對(duì)含有天然整合素αv蛋白的IEC細(xì)胞、ST細(xì)胞、PK15細(xì)胞、Vero E6細(xì)胞及仔豬小腸組織的膜蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果ST細(xì)胞、IEC細(xì)胞、及仔豬小腸組織蛋白均在130 ku左右有一條特異性條帶，與整合素αv蛋白大小相近，另外PK15細(xì)胞蛋白與其他3種蛋白在55～100 ku之間有多條條帶，此結(jié)果說(shuō)明制備的多克隆抗體能識(shí)別多種天然的整合素αv蛋白（圖4）。

圖4 Western blot鑒定多抗對(duì)天然整合素αv蛋白的識(shí)別Fig.4The identification of polyclonal antibody with natural integrin αv protein by western blot

3 討論

1987年自發(fā)現(xiàn)整合素受體家族以來(lái)[10]，研究學(xué)者們認(rèn)為整合素是有效的細(xì)胞粘附受體。整合素與其配體在免疫反應(yīng)、止血、白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、人類遺傳和癌癥或自身免疫疾病等方面有著至關(guān)重要的作用。整合素可作為血栓和炎癥治療藥物的靶蛋白，同時(shí)還可作為細(xì)菌和病毒的感染受體。由于整合素αv缺失I結(jié)構(gòu)域，所以必然會(huì)借助共價(jià)鍵與β亞基形成異源二聚體，同時(shí)也能增強(qiáng)β亞基的生物學(xué)功能，牟丹蕾等[11]也證實(shí)αvβ3共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，能有效的提高蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)。在驗(yàn)證多克隆抗體時(shí)，不同的細(xì)胞或組織蛋白在NC膜上出現(xiàn)了多個(gè)條帶，并且條帶之間存在一定的差異性，這或許是α亞基與β亞基形成的二聚體，在不同組織或細(xì)胞中含有的二聚體及其空間構(gòu)象均有所不同，它們可以共定位在細(xì)胞膜表面，在裂解細(xì)胞時(shí)沒(méi)有完全分開(kāi)，還有可能是在胞內(nèi)合成未成熟的蛋白，在裂解細(xì)胞時(shí)釋放出來(lái)。

研究成功構(gòu)建了豬整合素αv截短基因原核表達(dá)系統(tǒng)[12]，利用純化的表達(dá)蛋白免疫小鼠后獲得血清，進(jìn)一步驗(yàn)證了制備的血清能識(shí)別4種不同組織或細(xì)胞中的整合素αv。目前，市面上沒(méi)有銷售豬整合素αv商品化抗體。因此，研究制備的豬整合素αv多克隆抗體為病毒與受體互作等研究提供基礎(chǔ)。

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Preparation and Application of Polyclonal Antibody against Porcine Integrin αv

Wang Enyu，Gao Jing，Guo Donghua，Li Chunqiu，Sun Dongbo
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Construction of prokaryotic expression vector of porcine integrin αv gene，purification of fusion protein which was used to immunize mice to prepare and then to identify and apply the polyclonal antibody against porcine integrin αv gene.The extracellular domain and antigenicity gene sequence of porcine integrin αv was truncated after prediction and analysis.The gene sequence was synthesized according to optimize the Escherichia coli rare codon and cloned into the pGEX-6p-1 prokaryotic expression vector.The recombinant protein was expressed and purified and then identified by western blot which was immunized mice to prepare polyclonal antibody.The antibody titer was used indirect ELISIA method to detect，and then detect the response of natural integrin αv protein by Western blot.The 83 ku molecular weight recombinant protein was obtained.The polyclonal antibody titer was more than 1∶6 400 which was prepared by the purified of recombinant protein and it was able to react with native integrin αv protein.The polyclonal antibody against porcine integrin αv was prepared which provided some basis for following further related research.

pig;integrin αv;polyclonal antibody;recombinant protein;virus receptor

TS214.9

A

1002-2090（2017）04-0041-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.010

2017-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31472209）。

王恩雨（1993-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2015級(jí)碩士研究生。

孫東波，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：dongbosun@126.com。