王 瀟

(四川友誼醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610000)

·論著·

miR-205通過靶向調(diào)控caspase-3表達(dá)調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為

王 瀟

(四川友誼醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610000)

目的探討微小RNA-205、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(cyserinly aspartate-specific protease,caspase-3)表達(dá)水平對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的影響及其可能的作用機(jī)制。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)30例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中miR-205表達(dá)水平；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將miR-205 模擬物(miR-205 mimics)、對(duì)照(control mimics)、miR-205抑制物(miR-205-inhibitor)導(dǎo)入至U251細(xì)胞中，以Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力；采用生物信息學(xué)及熒光蛋白報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-205對(duì)caspase-3的靶向調(diào)控作用；采用RNA干擾技術(shù)研究U251細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞克隆數(shù)量變化。結(jié)果神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織miR-205表達(dá)值低于正常腦組織(P<0.05),30神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中28例miR-205下調(diào)2倍以上。將miR-205模擬物或miR-205抑制劑轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在miR-205的表達(dá)水平上，miR-205模擬物顯著高于對(duì)照，miR-205抑制物低于對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-205模擬物轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后caspase-3蛋白表達(dá)高于對(duì)照轉(zhuǎn)染后細(xì)胞(P<0.05)。miR-205模擬物+pcDNA3-Wt共轉(zhuǎn)染組熒光值顯著高于對(duì)照及miR-205模擬物+pcDNA3-Mut(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-205模擬物組，其細(xì)胞克隆形成明顯少于對(duì)照組及空白組，而轉(zhuǎn)染miR-205 inhibitor后，其細(xì)胞克隆形成則多于空白組(P<0.05)。結(jié)論多數(shù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤存在miR-205表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，而miR-205可能通過靶向調(diào)控caspase-3影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、增殖、克隆形成能力，這將為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)及治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供有力依據(jù)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；微RNAs；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的一種腦腫瘤，在我國(guó)發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的40%～50%[1]。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，手術(shù)無法完全切除，而放化療又易對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，該病一直處于高復(fù)發(fā)率、高病死率及低治愈率的局面[2]。因此，從分子機(jī)制角度對(duì)疾病進(jìn)行干預(yù)或許可為目前的治療困境提供新的思路。微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中占有重要調(diào)控作用，如miR-205在肺癌[3]、乳腺癌[4]、腎癌[5]等惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)，且對(duì)癌癥的增殖、侵襲、凋亡具有調(diào)控作用。但目前miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究涉及較少。因此，本研究將從組織及細(xì)胞水平對(duì)miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療提供新的藥物靶點(diǎn)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；30例神經(jīng)膠質(zhì)瘤[男性18例，女性12例，年齡13～72歲，平均(44.6±14.6)歲；腫瘤部位：額葉12例，顳葉10例，頂葉8例；根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類：Ⅰ～Ⅱ級(jí)11例，Ⅲ～Ⅳ19例]及其配對(duì)組織miRNAs的cDNA文庫、pcDNA3/綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)來自本實(shí)驗(yàn)室；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco；miRNAPCR試劑盒、U6及miR-205特異性引物、miR-205模擬物、miR-205-抑制物、對(duì)照QIAGEN、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine2000均購自Invitrogen；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自大連Takara公司；PCR引物及DNA片段由大連Takara公司合成；Transwell板購自BD；caspase-3siRNA及control、鼠抗人caspase-3一抗及β-actin一抗購自Abcam公司；羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 購買的U251是神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，屬于傳代細(xì)胞系，可穩(wěn)定傳代并用于實(shí)驗(yàn)研究。將含有U251細(xì)胞的凍存管從液氮中拿出，并迅速放入37℃水浴鍋中搖晃至完全溶解，隨后按1∶9體積比加入無血清培養(yǎng)基DMEM，以500r/min離心8min，去上清，加入1mL完全培養(yǎng)基(DEME+10%血清)重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加5mL完全培養(yǎng)基，搖勻，放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代。細(xì)胞傳代2～3次后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取上述培養(yǎng)的U251細(xì)胞，按5×103cell/孔接種至6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至60%～70%時(shí)，將完全培養(yǎng)基替換成無血清DMEM培養(yǎng)基，并根據(jù)Lipofectamine2000試劑使用說明書，將miR-2015及對(duì)照品、caspase-3siRNA及對(duì)照品轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染5～8h時(shí)，將無血清培養(yǎng)基替換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2d。收集細(xì)胞，提取RNA、蛋白進(jìn)行相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)以及Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RT-PCR取Trizol抽提的總RNA1μL,按FermentasRevertAid逆轉(zhuǎn)錄說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以RT-PCR驗(yàn)證miR-205的表達(dá)情況，其步驟按照SYBRPrimeSCrpitmiRNART-PCR說明書添加試劑。Caspase-3引物序列：上游5′-GGCATGGAGAACACTGAAAAC-3′；下游5′-GCGAATCTGTTTCTTTGCATG-3′。其反應(yīng)條件為：95 ℃ 5min，95 ℃ 10s，62 ℃ 20s，35個(gè)循環(huán)。U6為內(nèi)參引物序列：上游5′-CTCGCTTCGG-CAGCACA-3′；下游5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′。

1.2.4 載體構(gòu)建 依據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，將合成的含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)以及miR-205結(jié)合位點(diǎn)的caspase-3正反鏈DNA片段和缺失結(jié)合miR-205位點(diǎn)的正反鏈DNA片段，重組至熒光報(bào)道載體pcDNA3/EGFP中，從而獲得野生型報(bào)告載體(pcDNA3-Wt)及突變型報(bào)告載體(pcDNA3-Mut)。野生型正反鏈序列為：上游5′-CTAGCTAGCACGGGCCGCATTTAAAGTAAAG-3′;下游5′-CCGCTCGAGGAAGCACGCACCGAGA-CG-3′。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5min，95 ℃ 30s，67 ℃ 30s，35 個(gè)循環(huán)。突變型引物序列：上游5′-CTAGCTAGCACGGGCCGCATTTAAAGTAA-3′；下游5′-CTAGTCTAGATATATGGTCCAT-GATATT-3′。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5min，95 ℃ 30s，66 ℃ 30s，35個(gè)循環(huán)。

1.2.5 靶基因檢測(cè) 將合成的miR-205模擬物、對(duì)照模擬物分別與構(gòu)建的熒光報(bào)告載體或空載體(pcDNA3/EGFP)共轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h，用RAPI裂解細(xì)胞對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。在507nm下測(cè)定樣品中EGFP的熒光值。

1.2.6Westernblot實(shí)驗(yàn) 設(shè)置miR-205單轉(zhuǎn)染組、miR-205+野生型報(bào)告載體(pcDNA3-Wt)組及miR-205+突變型報(bào)告載體(pcDNA3-Mut)組。將其轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后24h,收集細(xì)胞，用RAPI低溫裂解細(xì)胞30min，吸取裂解液，以4 ℃ 12 000r/min離心20min，取上清，測(cè)定總蛋白濃度，并以每孔30μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉，分別加入caspase-3一抗(1∶2 000稀釋)及β-catin一抗(1∶2 500稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1h，PBST洗滌3次，ECL底物顯色。

1.2.7Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室從-20 ℃冰箱中取出室溫平衡30min后，取出小室放入24孔板中，上下室分別加入500μL完全培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中水化2h，隨后棄去上下室培養(yǎng)基。往小室中加入密度為1×107/mL細(xì)胞懸液500μL后，將小室放置到含有完全培養(yǎng)基的24孔板中。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，吸棄上下室液體，用干凈棉簽擦凈Transwell膜上室內(nèi)細(xì)胞后，PBS洗滌3次，并用預(yù)冷的甲醇固定Transwell下室細(xì)胞，以1%結(jié)晶紫染色8～10min后，以流水清洗多余結(jié)晶紫，吸水紙吸干后放于顯微鏡下觀察。

1.2.8 軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn) 設(shè)置miR-205模擬物組、miR-205inhibitor組、對(duì)照組及空白細(xì)胞組。4組均按照“1.2.2”項(xiàng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別與0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖按等比例混合，并以1×105cell/mL濃度接種至培養(yǎng)皿中，每組3個(gè)板，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)。記錄培養(yǎng)2周后各組克隆形成數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平 以正常腦組織中miR-205表達(dá)值1.00±0.03為參照，30例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織miR-205表達(dá)值為0.27±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.545,P=0.000)。30例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中28例miR-205下調(diào)2倍以上。

2.2miR-205在U251細(xì)胞中的表達(dá) 將miR-205模擬物或miR-205抑制劑轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在miR-205的表達(dá)水平上，miR-205模擬物組顯著高于對(duì)照組和miR-205抑制物組，且miR-205抑制物組低于對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

Transwell結(jié)果顯示，隨著miR-205表達(dá)量上調(diào)，U251遷移能力及數(shù)量均顯著下降，而當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-205inhibitor時(shí)，細(xì)胞遷移能力及數(shù)量則有所增加(圖1)。

組別 miR-205表達(dá)水平miR-205模擬物組6.43±0.32對(duì)照組 1.15±0.42*miR-205抑制物組0.78±0.33*# F 5.234 P 0.005

*P<0.05與miR-205模擬物組比較 #P<0.05與對(duì)照組比較(SNK-q檢驗(yàn))

圖1 細(xì)胞遷移結(jié)果A.對(duì)照組;B.miR-205模擬物;C.miR-205抑制物Figure1 Resultsofcellmigration

2.3 miR-205靶向調(diào)控caspase-3的表達(dá) 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果分析顯示，caspase-3 mRNA 3′-UTR的134-145區(qū)域與miR-205存在互補(bǔ)(圖2)。Western blot驗(yàn)證,miR-205模擬物轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后caspase-3蛋白表達(dá)(0.95±0.08)高于對(duì)照轉(zhuǎn)染后細(xì)胞(0.36±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SNK-q=8.135,P<0.05)(圖3)。熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-205模擬物+pcDNA3-Wt共轉(zhuǎn)染組熒光值(0.94±0.04)顯著高于對(duì)照(0.32±0.04)及miR-205模擬物+pcDNA3-Mut(0.55±0.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SNK-q=8.183、6.284,P<0.01)。證明miR-205能夠特異性結(jié)合Caspase-3的3′-UTR區(qū)域，從而使熒光蛋白表達(dá)水平顯著增加，而Caspase mRNA的3′-UTR結(jié)合區(qū)域突變后，則無此現(xiàn)象，提示caspase-3是miR-205的靶基因。

圖2生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

Figure2Resultsofbioinformaticsprediction

圖3 Western blot結(jié)果

Figure3ResultsofWesternblot

2.4 軟瓊脂實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染miR-205 模擬物組，其細(xì)胞克隆形成明顯少于對(duì)照組和空白組；而轉(zhuǎn)染 miR-205 抑制物后，其細(xì)胞克隆形成則多于對(duì)照組和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4,表2。

圖4各組U251細(xì)胞克隆形成結(jié)果

A.空白;B.對(duì)照模擬物;C.miR-205模擬物;D.miR-205抑制劑

Figure4U251cellcolonyformationineachgroup

組別 克隆數(shù)空白組 134.3±16.8miR-205模擬物組18.4±4.3*#對(duì)照組 128.5±15.9miR-205抑制物組178.4±18.5*#F 7.285P 0.002

*P<0.05與空白組比較 #P<0.05與對(duì)照組比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.5 caspase-3表達(dá)對(duì)U251生物學(xué)功能的影響 為進(jìn)一步觀察caspase-3是否參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆的形成，采用siRNA技術(shù)成功降低caspase-3表達(dá)水平后，通過Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-205模擬物、miR-205模擬物+pcDNA3-Wt、miR-205模擬物+pcDNA3-Wt+siRNA、miR-205模擬物+pcDNA3-Mut的U251細(xì)胞，并以單轉(zhuǎn)染miR-205模擬物的caspase-3表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)(1.00±0.12)。caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞克隆數(shù)量明顯減少。見表3。

組別caspase-3灰度值克隆數(shù)miR-205模擬物1.00±0.1215.32±6.27miR-205模擬物+pcDNA3-Wt3.24±0.34*3.67±1.25*miR-205模擬物+pcDNA3-Wt+siRNA0.48±0.13*#25.82±5.91*#miR-205模擬物+pcDNA3-Mut2.25±0.29*#△10.28±2.26*#△F804.377129.424P0.0000.000

*P<0.05與miR-205模擬物比較 #P<0.05與miR-205模擬物+pcDNA3-Wt比較 △P<0.05與miR-205模擬物+pcDNA3-Wt+siRNA比較(SNK-q檢驗(yàn))

3 討 論

3.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤、microRNA研究現(xiàn)狀 目前，我國(guó)神經(jīng)膠質(zhì)瘤成人發(fā)病率約為6/10萬，但5年病死率高達(dá)80%，其中以高度惡性的多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病死率最高，其患者中位數(shù)生存期<1年[6]。然而，腫瘤的發(fā)生及發(fā)展常涉及多種機(jī)制，且關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病因及發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說，如細(xì)胞凋亡抑制、細(xì)胞過度增殖等。因此，通過調(diào)節(jié)某種特點(diǎn)蛋白或mRNA的表達(dá)來觀察細(xì)胞增殖、凋亡等將有助于進(jìn)一步了解神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制。

miRNA在腫瘤中的作用機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)之一。其主要是一類高度保守，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后可發(fā)揮調(diào)控的非編碼小RNA，其通過與下游靶基因mRNA3′-UTR序列配對(duì)，抑制或降解靶基因mRNA，并最終導(dǎo)致蛋白翻譯失敗。近年來，關(guān)于miRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中報(bào)道顯著增加。如Quintavalle等[7]發(fā)現(xiàn)敲除miR-21后，可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡及減弱侵襲力。孫利波等[8]則發(fā)現(xiàn)miR-10b高表達(dá)可促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖能力增強(qiáng)，并使處于S期的細(xì)胞增多。Gao等[9]發(fā)現(xiàn)miR-34a作用與以上2種miRNA截然相反，轉(zhuǎn)染miR-34a的U251細(xì)胞其細(xì)胞增殖減弱，而凋亡細(xì)胞明顯增多。由此可見，不同的miRNA對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用存在差異[10]。本研究結(jié)果顯示,miR-205表達(dá)上調(diào)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及細(xì)胞克隆的形成。

3.2 miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)意義 本研究結(jié)果顯示，miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平顯著低于正常腦組織，而通過轉(zhuǎn)染技術(shù)提高miR-205在U251細(xì)胞中的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，U251細(xì)胞侵襲能力明顯下降，給予miR-205 inhibitor后，其侵襲能力恢復(fù)甚至高于空白組。提示miR-205在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起到抑癌作用。目前已經(jīng)證實(shí)，miR-205可調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)、E2F1、Bcl-2等表達(dá)。其中VEGF-A是促腫瘤微血管生產(chǎn)的重要蛋白，高表達(dá)VEGF-A可激活酪氨酸激酶，促發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移，從而引起新生血管生成[11]；而E2F1則可調(diào)控細(xì)胞周期，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞由G1向S期進(jìn)展加快[12]；Bcl-2則是細(xì)胞凋亡途徑中的重要調(diào)控蛋白。

3.3 caspase-3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)意義 caspase家族是一類細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行蛋白，而caspase-3更是該家族中的核心蛋白，且一直被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡中最后的共同通道[13]。其對(duì)于腫瘤凋亡的作用也已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，如在胃癌、肝癌、前列腺癌等中均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象[14]。本研究通過軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)caspase-3表達(dá)上升時(shí)，其細(xì)胞克隆數(shù)量明顯下降，而采用siRNA干擾技術(shù)阻斷caspase-3的表達(dá)，其細(xì)胞克隆數(shù)量明顯增多。結(jié)合caspase-3在細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用，可能由于大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，從而使細(xì)胞侵襲、增殖及成瘤作用受到影響[15]。

3.4 miR-205通過靶向調(diào)控caspase-3表達(dá)調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為 通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及構(gòu)建熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)，當(dāng)miR-205與野生型caspase-3同轉(zhuǎn)染后，熒光蛋白表達(dá)水平顯著高于miR-205與突變型caspase-3，且干擾caspase-3的表達(dá)后細(xì)胞克隆形成數(shù)量及侵襲性趨勢(shì)與下調(diào)miR-205結(jié)果相似。由此推測(cè)caspase-3是miR-205的靶向蛋白之一，并且高表達(dá)caspase-3有助于抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲及增殖。

綜上所述，miR-205或可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療或診斷的新指標(biāo)。上調(diào)miR-205表達(dá)有利于降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲及細(xì)胞增殖能力，caspase-3作為miR-205的靶向基因，下調(diào)caspase-3的表達(dá)水平也可獲得上調(diào)miR-205表達(dá)的相同效果。

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(本文編輯：趙麗潔)

Effect of miR-205 on the biological behavior of glioma via targeting caspase-3

WANG Xiao

(DepartmentofOncology，theFriendshipHospitalofSichuanProvince,Chengdu610000，China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofmicroRNA-205andaspartate-specificcaspase-3expressiononthebiologicalbehaviorofgliomaanditspossiblemechanism.MethodsTheexpressionofmiR-205in30casesofgliomatissueandnormalbraintissuewasdetectedbyreal-timefluorescencequantitativePCR.ThemiR-205mimics,controlmimics,miR-205inhibitor(miR-205-inhibitor)wasintroducedintoU251cellsandtheinvasiveabilityofthecellswasobservedbyTranswellassay.TheeffectofmiR-205oncaspase-3wastestedbybioinformaticsandfluorescentproteinreporterassay.Theexpressionlevelofcaspase-3proteinandthenumberofcellclonesinU251cellswerestudiedbyRNAinterferencetechnique.ResultsTheexpressionofmiR-205ingliomatissuewaslowerthanthatinnormalbraintissue(P<0.05),and28casesofgliomatissuewere28timeslowerthanthatofmiR-205.ThemiR-205mimeticormiR-205inhibitorwastransfectedintoU251cellsandfoundthatmiR-205mimicsweresignificantlyhigherthanthoseofcontrolatmiR-205expressionlevels,andthatofmiR-205waslowerthanthatofcontrol.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Theexpressionofcaspase-3proteininU251cellstransfectedwithmiR-205mimicswashigherthanthatincontroltransfectedcells(P<0.05).ThefluorescencevalueofmiR-205mimics+pcDNA3-Wtco-transfectiongroupwassignificantlyhigherthanthatofcontrolandmiR-205mimics+pcDNA3-Mut(P<0.05).ThemiR-205mimeticgroupwastransfectedintomiR-205mimeticgroup,anditscellcloneformationwassignificantlylessthanthatofthecontrolgroupandtheblankgroup.AftertransfectionofmiR-205inhibitor,thecellcloneformationwasmorethanthatintheblankgroup(P<0.05).ConclusionMostofthegliomashavemiR-205expressiondownregulation,andmiR-205mayinfluencetheinvasion,proliferationandclonalabilityofgliomacellsbytargetingcaspase-3,whichwillprovideapowerfulbasisforfurtherunderstandingandtreatmentofglioma.

glioma；microRNAs；caspase-3

2016-03-15；

2016-05-02

王瀟(1978-)，男，江蘇南京人，四川友誼醫(yī)院主

R730.264

A

1007-3205(2017)09-1024-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.008

治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事腫瘤的化療與分子靶向治療研究。