潘文森，肖冉冉，關(guān)繼濤，李愛民，楊紅申

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸二科，河北 石家莊 050000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸一科，河北 石家莊 050000;3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050000)

·論著·

阿托伐他汀對哮喘大鼠氣道炎癥、重塑及血清學(xué)相關(guān)炎癥指標(biāo)的影響

潘文森1，肖冉冉1，關(guān)繼濤2，李愛民3，楊紅申1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸二科，河北 石家莊 050000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸一科，河北 石家莊 050000;3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050000)

目的探討阿托伐他汀對卵清白蛋白致敏哮喘模型大鼠氣道炎癥和重塑的影響。方法清潔級健康SD雄性大鼠24只按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、哮喘組和阿托伐他汀組，每組8只。大鼠哮喘模型采用卵清白蛋白致敏和激發(fā)，0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行致敏和激發(fā)的大鼠為對照組，阿托伐他汀組在致敏和激發(fā)前以阿托伐他汀灌胃。采用肺功能檢測3組大鼠氣道呼氣阻力；ELISA法測定3組實(shí)驗(yàn)動物血清中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)及其組織學(xué)抑制物1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)的水平，并計(jì)算MMP-9/TIMP-1比值。結(jié)果哮喘組和阿托伐他汀組氣道阻力高于對照組，阿托伐他汀組氣道阻力低于哮喘組(P<0.05)。病理檢查顯示哮喘組氣道炎癥明顯，阿托伐他汀組與之相比炎癥輕微。哮喘組和阿托伐他汀組TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平高于對照組,MMP-9/TIMP-1低于對照組,阿托伐他汀組TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平低于哮喘組(P<0.05)；阿托伐他汀組MMP-9/TIMP-1與哮喘組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論阿托伐他汀能夠明顯降低哮喘大鼠的氣道基本阻力，減輕哮喘大鼠氣道炎癥。阿托伐他汀治療能夠降低血清中TGF-β1、VEGF、MMP-9及TIMP-1水平，或?yàn)槠錅p輕炎癥及氣道重塑的機(jī)制。

哮喘；阿托伐他?。淮笫?/p>

支氣管哮喘的病生理學(xué)改變主要為慢性氣道炎癥，并伴隨內(nèi)膜、肌層增厚等氣道重塑改變[1-2]。氣道重塑與多種促纖維化細(xì)胞因子有關(guān)，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowfactor-β1,TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)與之關(guān)系尤為密切[3-4]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)可分解胞外基質(zhì)破壞氣道壁基底膜，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase-1,TIMP-1)是MMP-9的內(nèi)源性抑制劑，在哮喘病兩者之間的平衡被認(rèn)為可能與氣道重塑有關(guān)聯(lián)[5]。另外一些研究證實(shí)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorsγ,PPARγ)參與調(diào)控炎癥相關(guān)細(xì)胞，應(yīng)用PPARγ激動劑能夠同時抑制氣道炎癥和氣道重塑過程，他汀類藥物能增加人外周血單核細(xì)胞上PPARγ的表達(dá)，或許是其影響哮喘發(fā)病的機(jī)制之一[6-8]。本研究以阿托伐他汀干預(yù)哮喘大鼠，通過觀察大鼠血清中VEGF、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1的水平及MMP-9/TIMP-1比值變化，探討阿托伐他汀在哮喘發(fā)病中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 采用購買的SD大鼠，雄性，24只，平均體質(zhì)量200g。隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、哮喘組和阿托伐他汀3組，每組8只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 應(yīng)用VEGF、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1ELISA試劑盒(美國R&D公司)；雞卵清白蛋白(美國Sigma公司)；阿托伐他汀(美國輝瑞)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 致敏和激發(fā) 哮喘組：實(shí)驗(yàn)開始1d、7d， 腹腔注射含OVA100mg和氫氧化鋁100mg的混懸液2mL和百日咳疫苗1mL。自15d開始，隔日1次，每次30min，霧化吸入OVA進(jìn)行激發(fā)。激發(fā)4次后增加1次OVA濃度，激發(fā)濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，累計(jì)激發(fā)20次。阿托伐他汀組：實(shí)驗(yàn)流程同哮喘組，同時服用阿托伐他汀4mg·kg-1·d-1，至研究結(jié)束。對照組：試驗(yàn)流程同哮喘組，致敏、激發(fā)均選擇生理鹽水。

1.2.2 氣道阻力測試 大鼠麻醉后(腹腔注射，戊巴比妥鈉，100mg/kg)，氣管切開并插管，接呼吸機(jī)機(jī)械通氣，穩(wěn)定后檢測氣道阻力。

1.2.3VEGF、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1的ELISA檢測 處死動物，穿刺右心室采血，3 000r/min離心10min，留取血清。按試劑盒說明書，檢測VEGF、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1水平。

1.2.4 制作病理標(biāo)本 4%甲醛固定右肺上葉，酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟后冷卻、石蠟包埋。切片機(jī)切片(厚約5μm)，干燥、二甲苯脫蠟，常規(guī)蘇木精及伊紅(HE)染色，觀察組織病理變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組氣道阻力比較 哮喘組和阿托伐他汀組氣道阻力高于對照組，阿托伐他汀組氣道阻力低于哮喘組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 病理學(xué)結(jié)果 對照組大鼠支氣管、肺組織均呈正常表現(xiàn)，支氣管管腔規(guī)則，黏膜上皮、肌層結(jié)構(gòu)正常，肺組織結(jié)構(gòu)規(guī)則無異常，所檢組織均未見炎癥改變；哮喘組大鼠可見支氣管黏膜破壞，明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，可見基底膜增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，杯狀細(xì)胞表達(dá)增加，黏液分泌增加；阿托伐他汀組大鼠鏡下可見黏膜破壞，炎癥細(xì)胞浸潤及杯狀細(xì)胞表達(dá)增加，黏液分泌也有增加，但與較哮喘組相比明顯減輕。見圖1。

表1 3組氣道阻力比較
Table1Comparisonofairwayresistanceamongthreegroups

組別 氣道阻力對照組 1.093±0.212哮喘組 1.779±0.159*阿托伐他汀組1.454±0.111*#F 73.976P 0.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與哮喘組比較(q檢驗(yàn))

圖1大鼠肺組織

A.對照組(HE ×100);B.對照組(HE ×200)；C. 哮喘組(HE ×100);D.哮喘組(HE ×200);E.阿托伐他汀組(HE ×100);F.阿托伐他汀組(HE ×200)

Figure1Thelungtissueofrats

2.3 3組血清TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比較 哮喘組和阿托伐他汀組TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平高于對照組,MMP-9/TIMP-1低于對照組,阿托伐他汀組TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平低于哮喘組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；阿托伐他汀組MMP-9/TIMP-1與哮喘組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組別 TGF-β1(μg/L)VEGF(ng/L)MMP-9(μg/L)TIMP-1(μg/L)MMP-9/TIMP-1對照組 21.12±2.17129.53±8.8522.6±4.221.3±4.31.084±0.196哮喘組 60.69±7.27*196.54±13.58*60.8±6.2*73.3±5.5*0.829±0.057*阿托伐他汀組38.89±5.40*#159.78±14.17*#42.1±5.9*#45.6±4.4*#0.925±0.138*F 108.65458.32295.069239.4656.542P 0.0010.0010.0010.0010.193

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與哮喘組比較(q檢驗(yàn))

3 討 論

支氣管哮喘的基本發(fā)病機(jī)制和病理特征是氣道炎癥和氣道重塑，急性發(fā)病或癥狀遷延不愈、控制不佳時氣道管壁黏膜充血、水腫、增厚及分泌增加，隨病程進(jìn)展逐漸出現(xiàn)平滑肌增生、肥大和基底膜增厚、氣道內(nèi)徑減小等不完全可逆性改變，這些病理特征是氣道阻力大幅度增加，臨床上出現(xiàn)咳嗽、喘息及呼吸困難等的主要原因[1-2]。以往研究顯示，哮喘組大鼠氣道內(nèi)可見明顯黏膜充血、水腫及破壞，炎癥細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增加，黏液分泌亢進(jìn)，基底膜增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，所見氣道內(nèi)腔縮窄甚至閉鎖，呈現(xiàn)典型的哮喘病理改變，肺功能檢查提示氣道阻力較對照組顯著增加[9]。進(jìn)一步分析本研究中病理學(xué)和肺功能指標(biāo)，可見阿托伐他汀組大鼠氣道炎癥改變較哮喘組顯著改善，肺功能檢測的氣道阻力也顯著降低，提示阿托伐他汀或許通過減輕炎癥反應(yīng)來改善氣道阻力。

炎癥是造成氣道重塑的主要原因。TGF-β1在哮喘氣道炎癥和重塑的研究中尤為重要[3]。TGF-β1是體內(nèi)重要的促纖維化細(xì)胞因子，可能通過多個環(huán)節(jié)與途徑影響氣道重塑。因此，結(jié)合以往研究可以推斷TGF-β1過度表達(dá)或許與氣道重塑有關(guān)。本研究哮喘組與對照組相比，血清中TGF-β1水平顯著升高，病理學(xué)可見氣道炎癥、重塑指標(biāo)顯著加重，進(jìn)一步驗(yàn)證了TGF-β1的重要作用[9]。

血管生成是哮喘發(fā)病機(jī)制中氣道炎癥和組織重塑發(fā)生發(fā)展的重要階段，VEGF是血管生成重要病理生理基礎(chǔ)[10]。VEGF與哮喘氣道重塑的發(fā)生存在密切的關(guān)系，其可能的機(jī)制是通過影響氣道血管生成和平滑肌增生肥大而發(fā)生[4]。氣道平滑肌細(xì)胞可以分泌VEGF，同時平滑肌細(xì)胞有VEGF受體表達(dá)，VEGF調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞功能，影響氣道平滑肌細(xì)胞基質(zhì)的合成，增加內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞的遷移。近期研究表明，升高的VEGF與哮喘患者癥狀控制不佳密切相關(guān)[11]。國內(nèi)學(xué)者針對VEGF基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF單核苷酸序列中rs3025020和rs3025039多態(tài)性或許與哮喘發(fā)病有關(guān)[12]。針對過敏性鼻炎的研究也發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中VEGF及其可溶性受體也與發(fā)病機(jī)制相關(guān)[13]。

MMP-9可分解胞外基質(zhì)破壞氣道壁基底膜，TIMP-1是MMP-9的內(nèi)源性抑制劑，兩者之間的平衡直接影響哮喘患者的氣道重塑[5]。以往的研究中，主要針對糖皮質(zhì)激素對于MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比例的影響，針對他汀類藥物研究較少。本研究結(jié)果顯示，阿托伐他汀組MMP-9、TIMP-1顯著低于哮喘組(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1與哮喘組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示阿托伐他汀改善氣道炎癥及重塑或與抑制MMP-9過度分泌有關(guān)，MMP-9分泌下調(diào)后，內(nèi)源性TIMP-1相應(yīng)下調(diào)，MMP-9/TIMP-1比例輕度升高。除了大量的動物實(shí)驗(yàn)外，Chaudhuri等[14]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，吸煙的哮喘患者痰液中MMP-9/TIMP-1下降與氣道縮窄有關(guān)。本研究結(jié)果與其趨勢相一致。但本研究中阿托伐他汀組與哮喘組MMP-9/TIMP-1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，或與檢測時機(jī)有關(guān)，TIMP-1的變化較MMP-9有約2周的延遲，這需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

PPARs(尤其是PPARγ)與哮喘氣道炎癥和重塑相關(guān)，諸多研究顯示PPARγ激動劑能明顯抑制哮喘炎癥細(xì)胞的活化以及細(xì)胞因子的釋放[6]。PPARγ激動劑環(huán)格列酮能降低哮喘小鼠BALF中嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量以及腫瘤壞死因子2α等細(xì)胞因子的水平。另一種PPARγ激動劑羅格列酮能抑制縱隔淋巴結(jié)內(nèi)T 細(xì)胞的增殖和活化，并能影響淋巴結(jié)內(nèi)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素和干擾素γ的水平，能抑制OVA 誘導(dǎo)的氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集。因此，推斷PPARγ激動劑或可作為哮喘治療的新靶點(diǎn)[7-9]。但是，這一推論在臨床實(shí)踐中并未得到確切證實(shí)[15]。已證實(shí)他汀類藥物可以改善氣道重塑[16-17]。他汀類藥物還可以增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素對于CD4+淋巴細(xì)胞Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的平衡作用[18]。雖然機(jī)制尚未完全明了，Huang等[19]研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以有效減少哮喘患者急性發(fā)作引起的住院需求。

本研究結(jié)果顯示阿托伐他汀干預(yù)改善了大鼠的氣道炎癥及重塑過程，大鼠血清TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平低于模型組。推測阿托伐他汀或許通過上調(diào)PPARγ的表達(dá)，進(jìn)而影響TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1，并最終改善了氣道炎癥和重塑。

總之，阿托伐他汀可能通過影響TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1代謝，調(diào)節(jié)氣道炎癥和重塑，其機(jī)制有待更深入的研究揭示。

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(本文編輯：趙麗潔)

Effect of atorvastatin on airway inflammation, remodeling and serology related inflammatory indexes in asthmatic rats

PAN Wen-sen1， XIAO Ran-ran1， GUAN Ji-tao2， LI Ai-min3， YANG Hong-shen1

(1.TheSecondDepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhang050000，China; 2.TheFirstDepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhang050000，China; 3.DepartmentofReproductiveMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhang050000，China)

ObjectiveToexploretheeffectsofatorvastatinonairwayinflammationandremodelinginratswithasthma.MethodsSDmaleratswereusedasexperimentalanimals.Twenty-fourratsweredividedintothreegroupsrandomly.Theasthmagroupandatorvastatingroupweresensitizedandchallengedbyovalbumin.Salinewereusedtobethesensitizedandchallengeddruginthecontrolgroup.Airwayresistanceoftheanimalswasmeasuredbyanimallungfunctionmeter.Theairwayinflammationwasobservedbypathologicalmethod.Thelevelsofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF),transforminggrowthfactor-β1(TGF-β1),matrixmetalloproteinase-9(MMP-9)andtissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase-1(TIMP-1)inserumweremeasuredbyELISA.AndtheMMP-9/TIMP-1ratiowasalsobeencalculated.ResultsTheairwayresistancewashigherinasthmagroupandatorvastatingroupthanthatinnormalcontrolgroup.Andtheairwayresistancewaslowerinatorvastatingroupthanthatinasthmagroup(P<0.05).Theinflammationobservedbypathologicalmethodwasobviousinasthmamodelgroup,andthatwereslighterinatorvastatingroupswhencomparedwithasthmamodelgroup.ThelevelsofTGF-β1,VEGF,MMP-9andTIMP-1werehigherinasthmamodelgroupandatorvastatingroupthannormalcontrolgroup,andtheMMP-9/TIMP-1ratioinnormalcontrolgroupwerelowerthanasthmagroupandatorvastatingroup.ThelevelsofTGF-β1,VEGF,MMP-9andTIMP-1werelowerinatorvastatingroupcomparedwithasthmamodelgroup(P<0.05),buttherewasnoobviousdifferenceintheMMP-9/TIMP-1ratiobetweenasthmamodelgroupandatorvastatingroup(P>0.05).ConclusionAtorvastatinimproveairwayresistance,inflammationandremodelinginratswithasthma.AtorvastatincoulddecreasetheserumlevelsofVEGF,TGF-β1,MMP-9andTIMP-1,whichmayplayimportantrolesinpreventionofinflammationandremodeling.

asthma;atorvastation;rats

2017-06-14；

2017-07-12

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20100068)

潘文森(1974 -)，男，河北景縣人，河北醫(yī)科大學(xué)第

R562.25

A

1007-3205(2017)09-1007-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.004

二醫(yī)院主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事呼吸系統(tǒng)疾病診治研究。