朱雪云，李建謀，王海燕，孔凡芹

金邊黃楊和金心黃楊葉綠素合成與葉綠體結(jié)構(gòu)分析

朱雪云，李建謀，王海燕，孔凡芹

(武漢生物工程學(xué)院園林系，湖北武漢 430415)

【目的】本文探索了金邊黃楊和金心黃楊彩葉形成的機(jī)理?！痉椒ā坷梅止夤舛扔?jì)和電子顯微鏡等，對(duì)金邊黃楊和金心黃楊葉片黃色和綠色組織的葉綠素含量和葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】黃色組織的葉綠素a和葉綠素b含量均顯著低于綠色組織和對(duì)照大葉黃楊。黃色組織中葉綠素合成中間產(chǎn)物原卟啉IX(ProtoIX)、Mg-ProtoIX以及Pchlide的含量急劇降低。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)黃色組織的葉綠體數(shù)量減少，內(nèi)膜排列紊亂，缺乏有序的基粒類囊體?！窘Y(jié)論】黃色組織葉綠素含量降低的原因可能是糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)向原卟啉IX(ProtoIX)合成過程出現(xiàn)障礙所致。

金邊黃楊;金心黃楊;黃色組織;葉綠素;葉綠體結(jié)構(gòu)

【研究意義】金邊大葉黃楊(Euonymus japonicus L.var.aureamarginatus)和金心大葉黃楊(E.japonicus L.var.aureovariegatus)(以下簡(jiǎn)稱金邊黃楊和金心黃楊)是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬大葉黃楊(E.japonicus L.)的2個(gè)變種[1]。金邊黃楊葉緣為黃色，中央為綠色;而金心黃楊葉片中心呈黃色，葉緣為綠色。它們屬于鑲邊類彩葉植物。彩葉植物因其特殊的葉片顏色而具有較高的觀賞價(jià)值，然而我國(guó)原產(chǎn)彩葉植物品種較少，彩葉形成機(jī)理和育種體系尚未建立[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】彩葉形成的遺傳因素主要?dú)w納為以下幾種:核基因突變、轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致基因重組、質(zhì)體發(fā)生突變、形成植物嵌合體、半配合遺傳等[3-5]。Chen等[6]總結(jié)前人的研究將彩葉的形成機(jī)制歸納為2種，一種是由核基因發(fā)生突變導(dǎo)致葉片一部分組織或細(xì)胞產(chǎn)生有缺陷的葉綠體，但綠色部分和白色(黃色)部分的遺傳背景是一致的，而突變表型只局限在白色或黃色組織中[7];另一種機(jī)制是白色(黃色)組織與綠色組織的遺傳組成(核基因或質(zhì)基因)不同，白色(黃色)組織具有突變的基因型而綠色組織具有野生型基因型，嵌合體[8]、轉(zhuǎn)座子刪除或插入[9]屬于此種情況。盡管彩葉植物的遺傳模式各異，但葉片彩斑形成歸根結(jié)底是色素分布不均導(dǎo)致。葉片黃-綠(白-綠)彩斑與葉綠體色素相關(guān)。而葉綠體色素含量的變化主要與葉綠體色素合成和降解代謝，或者與葉綠體的發(fā)育、結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)的異常有關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】本研究對(duì)金邊黃楊和金心黃楊彩葉葉綠素合成過程以及葉綠體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，初步掌握其彩葉形成的生理生化特點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為彩葉形成的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的金邊黃楊(Euonymus japonicus L.var.aureamarginatus)、金心黃楊(E.japonicus L. var.aureovariegatus)和大葉黃楊(E.japonicus L.) (對(duì)照)當(dāng)年生枝條形態(tài)學(xué)上端的第二對(duì)完全展開的成熟葉片為試材。各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定時(shí)，將金邊黃楊和金心黃楊葉片的綠色和黃色組織切分開，分別進(jìn)行測(cè)定。

1.2 研究方法

1.2.1 葉綠體色素含量測(cè)定 取0.1 g葉片剪碎研磨加入少量95%的乙醇混合至勻漿，轉(zhuǎn)入離心管并定體積至10 mL，于8000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，在波長(zhǎng)665、649和470 nm下測(cè)定吸收值，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量。

1.2.2 δ-氨基乙酰丙酸(ALA)的測(cè)定 ALA的提取及其含量測(cè)定按照王凌健等[10]方法，分別稱取金邊和金心黃楊葉片綠色和黃色組織各0.2 g，加入4 %的三氯乙酸充分研磨，8000 r/min離心5 min，取1 mL提取液加入500μl NaAc(1 M)和50μl乙酰丙酮，沸水浴10 min后冷卻到室溫，再8000 r/min離心5 min，取1.5mL上清液加入1.5 mL Ehrlich-Hg試劑在黑暗中反應(yīng)15min后，在553 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.3 膽色素原(PBG)的測(cè)定 PBG的含量測(cè)定按照Bogorad[4]方法，分別稱取金邊和金心黃楊葉片綠色和黃色組織各0.2 g，液氮研磨后，加入5 mL提取緩沖液(0.6 mol·L-1Tris，0.1M EDTA，pH8.2)充分研磨后，12 000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液加入1.5 mL Ehrlich-Hg，在黑暗中反應(yīng)15 min，553 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.4 尿外啉原Ⅲ(UrogenⅢ)和糞外啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)的測(cè)定 尿卟啉原Ⅲ和糞卟啉原Ⅲ含量的測(cè)定按照Bogorad[11]方法，稱取葉片綠色和黃色組織各0.2 g，液氮研磨后，加入5 mL磷酸緩沖液(0.067 M pH 6.8)，12 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清加入150μl1%的Na2S2O3，劇烈震蕩，光照20min，用冰醋酸(1 mol/L)調(diào)pH到3.5，然后用乙醚萃取，分層后，測(cè)定水相在405.5 nm處吸光值，得UrogenⅢ。測(cè)定醚相的399.5 nm處的吸光值，得CoprogenⅢ。

1.2.5 原外啉IX(ProtoIX)、Mg-原外啉IX(Mg-ProtoIX)、原葉綠素酸酯(Pchlide)含量的測(cè)定 采用Hodgins和van Huystee的方法[12]，分別取0.2 g，綠色和黃色葉片組織，加入5 mL 80%的丙酮研磨，在12 000 r/min、4℃下離心10 min，取上清液，用80 %的丙酮稀釋到25 mL，測(cè)定575、590和628 nm的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。葉綠素合成各中間產(chǎn)物均以大葉黃楊(視為100%)為參照計(jì)算相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 金邊黃楊和金心黃楊葉綠體色素含量分析

與大葉黃楊葉片相比，金邊黃楊和金心黃楊葉片的黃色組織中葉綠素a、b及類胡蘿卜素的含量均顯著低于大葉黃楊和綠色組織的含量(表1～2)。這一結(jié)果與肉眼觀察的現(xiàn)象一致。

2.2 金邊和金心黃楊葉綠素合成中間產(chǎn)物分析

大葉黃楊為對(duì)照，綠色和黃色組織各中間產(chǎn)物含量均以相對(duì)含量表示。綠色組織各中間產(chǎn)物的含量相對(duì)穩(wěn)定，而黃色組織葉綠素合成過程中各中間產(chǎn)物的相對(duì)含量變化幅度較大。金邊黃楊黃色組織的δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、膽色素原(PBG)、糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)的含量顯著低于綠色組織。特別是由CoprogenⅢ向ProtoIX轉(zhuǎn)變時(shí)出現(xiàn)急劇降低現(xiàn)象(圖1)。金心黃楊黃色組織中間產(chǎn)物的變化趨勢(shì)與金邊黃楊類似，但黃色組織ALA的含量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綠色組織，從PBG開始黃色組織各中間產(chǎn)物的含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，至原卟啉IX(ProtoIX)陡然下降。由此可見，2種彩葉植物黃色組織的葉綠素含量降低可能是由于在代謝層面上由CoprogenⅢ向ProtoIX合成過程出現(xiàn)障礙。

表1 金邊黃楊成熟葉片黃色和綠色組織中葉綠體色素含量Table 1 Chlorophyll contents in both green and yellow tissues of E.japonicus var.Aureamarginatus

表2 金心黃楊成熟葉片黃色和綠色組織中葉綠體色素含量Table 2 Chlorophyll contents in both green and yellow tissues of E.japonicus var.Aureovariegatus

2.3 金邊和金心黃楊綠色和黃色組織中葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

利用透射電子顯微鏡分別觀察了金邊黃楊和金心黃楊綠色和黃色組織中葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)和類囊體的垜曡程度。通過觀察發(fā)現(xiàn)黃色組織的細(xì)胞內(nèi)葉綠體的數(shù)量普遍較少，而且葉綠體中內(nèi)膜排列紊亂，缺乏有序的基粒類囊體，且嗜鋨顆粒多而大，甚至出現(xiàn)空泡現(xiàn)象(圖2)。光合作用相關(guān)的色素、蛋白質(zhì)和酶將失去其依存的場(chǎng)所。

3 討 論

目前，對(duì)金邊黃楊和金心黃楊彩葉形成的機(jī)理研究國(guó)內(nèi)外報(bào)導(dǎo)較少。2種彩葉植物的黃色組織葉綠素和類胡蘿卜素的含量相比正常的綠色組織和大葉黃楊均明顯降低。這與張開明等[13]和莊猛等[14]對(duì)金邊黃楊色素測(cè)定結(jié)果相符。再次說明金邊黃楊綠色和黃色組織顏色差異的直接原因是葉綠素的含量降低。然而，導(dǎo)致葉綠素含量降低的原因涉及方面較廣，十分復(fù)雜?？赡苁怯捎谌~綠素在合成過程中某一環(huán)節(jié)受阻，可能是葉綠素降解過程加速，也可能是葉綠體發(fā)育或結(jié)構(gòu)異常等等。

不少報(bào)道顯示，彩葉和黃化突變體葉綠素含量降低是由于葉綠素合成過程受阻引起[15-17]。為進(jìn)一步搞清楚葉綠素含量降低的原因，本研究對(duì)葉綠素合成的過程進(jìn)行了分析。分別測(cè)定了葉綠素合成中幾個(gè)關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、膽色素原(PBG)、尿卟啉原Ⅲ(UrogenⅢ)、糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)、原卟啉IX(ProtoIX)、Mg-原卟啉IX (Mg-ProtoIX)、原葉綠素酸酯(Pchlide)等成分在黃色組織中的含量變化。相比綠色組織和大葉黃楊葉片，黃色組織的ALA、PBG、UrogenⅢ和CoprogenⅢ相對(duì)含量均有降低現(xiàn)象，但從ProtoIX開始，Mg-ProtoIX以及Pchlide減少的幅度陡然上升。結(jié)果說明黃色組織的葉綠素合成過程受阻，且受阻位點(diǎn)可能在CoprogenⅢ和ProtoIX之間的反應(yīng)環(huán)節(jié)上。劉彩云[18]對(duì)白肋型煙草葉綠素合成過程分析發(fā)現(xiàn)合成過程的后期中間產(chǎn)物ProtoIX、Mg-ProtoIX和Pchlide的含量均顯著低于對(duì)照，與本研究的受阻位點(diǎn)一致。類似的研究結(jié)果在芥菜型油菜黃化突變體L638-y葉綠素合成中出現(xiàn)[16]。高等植物葉綠素生物合成由16種酶參與完成，而由CoprogenⅢ到ProtoIX的轉(zhuǎn)變是在糞卟啉原氧化脫羧酶和原卟啉原氧化酶的催化下完成[19]。推測(cè)這一反應(yīng)環(huán)節(jié)中相關(guān)的酶也許存在活性降低或表達(dá)量降低的可能性。

圖1 金邊黃楊(A)和金心黃楊(B)綠色和黃色組織葉綠素合成中間產(chǎn)物先對(duì)含量分析Fig.1 Analysis of the chlorophyll biosynthesis intermediatesboth E.japonicus.var.Aureamarginatus(A)and E.japonicus var.Aureovariegatus(B)

圖2 金邊黃楊和金心黃楊綠色和黃色組織中葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chloroplastmicrostructure in green and yellow tissues of E.japonicas var.Aureamarginatus and E.japonicus var.Aureovariegatus

葉片黃化的另一可能原因就是葉綠體結(jié)構(gòu)和發(fā)育出現(xiàn)問題。葉綠體類囊體膜是一個(gè)由各種葉綠素——蛋白質(zhì)復(fù)合體高度有組織性構(gòu)成的體系[20]。主要有光系統(tǒng)系Ⅰ(PSI)、光系統(tǒng)Ⅱ(PSII)及捕光色素復(fù)合體(LHC)等。這些復(fù)合體中光合色素可以達(dá)到35%[21]。有研究指出光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)的明顯減少引起葉綠素合成缺陷[22]。因此，與葉綠素結(jié)合的蛋白質(zhì)如果出現(xiàn)含量降低、缺失或結(jié)構(gòu)異常等變異很可能間接引起葉綠素含量降低。擬南芥LHCs蛋白質(zhì)顯著降低甚至缺失導(dǎo)致基粒類囊體的垛疊出現(xiàn)異常同時(shí)引起葉綠素缺失[23]。油菜葉綠素缺失突變體的LHCs、PSI、PSII、細(xì)胞色素復(fù)合體b6/f(Cyt b6f)以及葉綠體ATP合酶的豐度都出現(xiàn)了不同程度的降低[24]。本研究對(duì)金邊和金心黃楊綠色和黃色組織中的葉綠體分別進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，黃色組織中葉綠體內(nèi)膜沒有進(jìn)行有序折疊，也無明顯的基粒結(jié)構(gòu)，顯然在結(jié)構(gòu)上屬于不正常的葉綠體。葉綠體的基粒類囊體是光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ，以及色素-蛋白復(fù)合體實(shí)現(xiàn)功能必需依附的場(chǎng)所，由此可以推測(cè)黃色組織的光合作用和能力較低。這在莊猛等[14]的研究中得到印證。同時(shí)也說明基粒類囊體的缺失與色素含量降低存在正相關(guān)現(xiàn)象。有報(bào)道認(rèn)為，葉綠體結(jié)構(gòu)與葉綠素合成之間關(guān)系主要存在2種可能，一種是催化葉綠素合成的酶基因突變使葉綠素合成受阻，而膜結(jié)構(gòu)發(fā)育受阻只是葉綠素缺乏和葉綠素合成受阻的多效性反應(yīng);另一種可能是基因突變導(dǎo)致膜發(fā)育受阻，造成膜上酶復(fù)合體缺失而使葉綠素合成阻滯[25]。本研究中，黃色組織葉綠體結(jié)構(gòu)異常與葉綠素含量降低之間如何相互影響以及它們之間的因果關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，金邊黃楊和金心黃楊彩葉產(chǎn)生的直接原因是因?yàn)槿~綠素含量降低所致。而引起葉綠素含量降低的生理代謝問題產(chǎn)生在葉綠素合成過程中糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)到原卟啉IX(ProtoIX合)成過程。

[1]中國(guó)植物志[EB/OL].http://frps.eflora.cn/frps/Euonymus%20 japonicus.

[2]程金水.園林植物遺傳育種學(xué)[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社，2000:33-44.

[3]姜衛(wèi)兵，莊 猛，韓浩章，等.彩葉植物呈色機(jī)理及光和特性研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32(2):352-358.

[4]洪 麗，王金剛，龔束芳.彩葉植物葉色變化及相關(guān)影響因子研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(6):152-156.

[5]田立娟，趙瑞艷，翟登攀.彩葉植物的彩葉形成研究進(jìn)展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(2):118-120.

[6]Kusumi K，Komori H，Satoh H&Iba K.Characterization of a zebra Mutant of Rice with Increased Susceptibility to Light Stress[J]. Plant Cell Physiol.，2000，41(2):158-164.

[7]劉 生，魏祥進(jìn)，邵高能，等.一個(gè)水稻“斑馬葉”葉色突變體基因zebraleaf2(zl2)的圖位克隆[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2013，27(3): 231-239.

[8]Chen M，Choi Y D，Voytas D F，etal.Mutations in the Arabidopsis VAR2 locus cause leaf variegation due to the loss of a chloroplast FtsH protease[J].Plant Journal，2000，22:303-313.

[9]Tilney-Bassett R A E.Genetics of variegated plants[A].In Birky C W，Perlman PW，Byers T J，etal.Genetics and Biogenesis ofMitochonoria and Choloplasts[C].Columbus:Ohio State University Press，1975:268-308.

[10]王凌健，倪迪安，葉敘豐，等.植物葉片中δ-氨基乙酰丙酸的測(cè)定[J].植物生理學(xué)通訊，1997，35(6):439-441.

[11]Bogorad L.Porphyrin synthesis[J].Methods Enzymo，1962(5): 885-891.

[12]Hodgins R，van Huystee R B.Rapid simultaneous estimation of protoporphyrin and Mg-protophyrins in higher plants[J].Journal of Plant Physiology，1986，125:311-323.

[13]張開明，王 珂，祝亞軍，等.金邊黃楊和大葉黃楊的光能吸收分配特征及其機(jī)制分析[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，48(4): 429-434.

[14]莊 猛，姜衛(wèi)兵，花國(guó)平，等.金邊黃楊與大葉黃楊光合特性比較[J].植物生理學(xué)通訊，2006，42(1):39-42.

[15]劉中華，計(jì)瑋瑋，魯 聰，等.彩葉富貴竹葉綠素生物合成代謝的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(19):8963-8964，8985.

[16]呂 明.芥菜型油菜黃化突變體1638-y葉片缺綠的生化機(jī)制探討[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010.

[17]徐冬平.一份玉米全生育期黃花材料的初步研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013.

[18]劉彩云.普通煙草中的白肋型煙草葉色性狀遺傳及其質(zhì)體色素差異性研究[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文，2013.

[19]Chekunova E M.Genetic Control of the Chlorophyll Metabolism [J].Russian Journal of Genetics，2014，4(5):351-367.

[20]Ewa J，Joanna S，Waldemar M.Organization and functionality of chlorophyll-protein omplexes in thylakoid membranes isolated from Pb-treated Secale cereale[J].Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology，2013，125:98-104.

[21]Croce R，van Amerongen H.Light-harvesting and structural organization of photosystem II:from individual complexes to thylakoid membrane[J].Journal Photochem Photobiol，B:Biol.2011，104: 142-153.

[22]Zhou Y，Gong Z，Yang Z，et al.Mutation of the light-induced yellow leaf1 gene，which encodes a geranylgeranyl reductase，affects chlorophyll biosynthesis and light sensitivity in rice[J].PLoSOne，2013，8(9):1-14.

[23]Kim E H，Li X P，Razeghifard R，etal.Themultiple rolesof lightharvesting chlorophyll a/b-protein complexes define structure and optimize function of Arabidopsis chloroplasts:a study using two chlorophyll b-less mutants[J].Biochimica et Biophysica Acta，2009，1787:973-984.

[24]Chu P，Yan G X，Yang Q，et al.iTRAQ-based quantitative proteomics analysis of Brassica napus leaves reveals pathways associated with chlorophyll deficiency[J].Journal of Proteomics，2015，113: 244-259.

[25]William C T，Alice B，Robert A M.Use of nuclearmutants in the analysis of chloroplast Development[J].Devel Genet，1987(8): 305-320.

(責(zé)任編輯 陳 虹)

Analysis of Chlorophyll Biosynthesis and Chloroplast M icrostructure in Euonymus japonicus.var.Aureamarginatus and E.japonicus var.Aureovariegatus

ZHU Xue-yun，LIJian-mou，WANG Hai-yan，KONG Fan-qin
(Wuhan Bioengineering Institute，Landscape Gardening Department，HubeiWuhan 430415，China)

【Objective】In this paper，themechanism of the colored leaf in Euonymus japonicus.var.Aureamarginatus and E.japonicus var. Aureovariegatus were studied.【Method】The spectrophotometry and electron microscope technique were used，and their chlorophyll contents and chloroplast structurewere detected.【Result】The contentof chlorophyll in the yellow tissuesof both E.japonicus.var.Aureamarginatus and E.japonicus var.Aureovariegatus were much lower than the green tissues and the control E.japonicus.Furthermore，the intermediate products in the chlorophyll biosynthesis processwere analyzed，which indicated that Protoporphyrin IX weremarkedly decreased in yellow tissues of both varietas than green tissues and the control.For another，therewere few normal thylakoids in the chloroplastof yellow tissues of both varietas by transmission electronmicroscope analysis.【Conclusion】The chlorophyll biosynthesiswere blocked in coproporphyrinogenⅢconverted to Protoporphyrin IX in the yellow tissues.

Euonymus japonicus.var.Aureamarginatus;Euonymus japonicus var.Aureovariegatus;Yellow tissue;Chlorophyll;Chloroplast structure

S687

A

1001-4829(2017)8-1767-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.012

2016-07-20

武漢市教育局項(xiàng)目(2010097);國(guó)家自然科學(xué)基金(31401920);武漢市屬高校產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(201435)

朱雪云(1981-)，女，河北邯鄲人，博士，副教授，研究方向植物遺傳育種，E-mail:zhuxueyun1981@163.com。