王 鳳 齊軍倉 郭亞南 鄭許光 龔 磊 王少玉 陳阿龍 黃湘怡 李忠豪 宋瑞嬌

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子 832003)

人工老化處理對(duì)大麥種子萌發(fā)早期淀粉及淀粉酶活性的影響

王 鳳 齊軍倉 郭亞南 鄭許光 龔 磊 王少玉 陳阿龍 黃湘怡 李忠豪 宋瑞嬌

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子 832003)

采用高溫高濕人工老化處理的方法，探究老化處理對(duì)大麥種子淀粉粒及萌發(fā)早期淀粉含量和淀粉酶活性的影響。研究表明：人工老化處理未改變大麥種子胚乳淀粉粒的基本形態(tài)特征，但使萌發(fā)72 h的種子胚乳中小淀粉粒逐漸增加，大淀粉粒逐漸減少，且大淀粉粒表面赤道凹槽和小孔明顯減少；隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，大麥種子內(nèi)支鏈淀粉和直鏈淀粉的含量均呈增加的趨勢(shì)，α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活性均呈降低的趨勢(shì)，且老化15 d與對(duì)照相比，淀粉含量和淀粉酶活性差異均達(dá)到顯著水平。老化使淀粉酶活性降低，淀粉粒酶解減緩，從而導(dǎo)致大麥種子萌發(fā)早期淀粉的分解受到抑制。

大麥 人工老化 萌發(fā)早期 淀粉分解

種子老化不僅影響其萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，也會(huì)影響植株后期的生長(zhǎng)、產(chǎn)量及籽粒品質(zhì)。目前，研究發(fā)現(xiàn)老化會(huì)影響種子內(nèi)可溶性糖、蛋白質(zhì)等貯藏物質(zhì)含量的變化[1-2]。大麥作為啤酒生產(chǎn)的主要原料，淀粉是其主要的貯藏物質(zhì)，約占種子干重的64%左右，其中包括30%左右的直鏈淀粉和70%左右的支鏈淀粉。淀粉在大麥胚乳中以淀粉粒的形式存在，且大小差別較大，Kang等[3]將大麥淀粉粒分為大、小2種類型，而Takeda等[4]將大麥淀粉粒分為A、B、C(即大、中、小)3種類型，但由于B和C型淀粉粒大小差別較小，且二者的發(fā)生發(fā)育相似，故在觀察結(jié)構(gòu)時(shí)很難將B、C型淀粉粒明顯區(qū)分開[5]。目前，麥類種子淀粉和胚乳淀粉粒的超微結(jié)構(gòu)研究集中在種子發(fā)育的早期[6-9]，但是老化處理對(duì)大麥種子萌發(fā)過程中的淀粉及其超微結(jié)構(gòu)研究鮮見報(bào)道。

大麥種子淀粉的降解以淀粉酶水解途徑為主，淀粉磷酸化途徑為輔。其中，淀粉水解途徑的降解需要α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、極限糊精酶(EC 3.2.1.41)等的共同作用[10]。α-淀粉酶是內(nèi)切型淀粉酶，也是淀粉水解的起始酶，分解直鏈淀粉生成麥芽糖和麥芽三糖，而分解支鏈淀粉則生成麥芽糖、麥芽三糖和α-糊精，大麥種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性呈增加的趨勢(shì)[11-12]。β-淀粉酶是外切淀粉酶，不能分解支鏈淀粉的分支點(diǎn)，淀粉經(jīng)β-淀粉酶分解的產(chǎn)物是麥芽糖和α-糊精，β-淀粉酶活性水平在整個(gè)種子萌發(fā)過程中均要高于α-淀粉酶活性[13-14]。但是，淀粉不能被α-淀粉酶和β-淀粉酶完全降解，必須有極限糊精酶的參與才能徹底降解為可發(fā)酵的糖。極限糊精酶具有高度的特異性，專門水解支鏈淀粉和分支糊精中的α-1,6糖苷鍵，作用的產(chǎn)物是直鏈淀粉，在萌發(fā)過程中，極限糊精酶活性逐漸增強(qiáng)，但其含量遠(yuǎn)低于其他水解酶[15]。然而，老化對(duì)于大麥種子淀粉分解過程中催化、調(diào)控其水解的一系列酶的研究鮮見報(bào)道。

本研究采用高溫高濕人工加速老化法，對(duì)大麥種子進(jìn)行老化處理，研究老化處理對(duì)大麥種子胚乳淀粉粒及萌發(fā)早期淀粉含量和淀粉酶活性的影響，以期揭示大麥種子老化劣變對(duì)淀粉代謝產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用2014年7月石河子大學(xué)試驗(yàn)站收獲的春性二棱皮大麥甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、P12-8和9810種子作為試驗(yàn)材料，種子收獲后保存于15 ℃種子庫3～6個(gè)月備用[16]。

1.2 種子人工老化處理

采用高溫高濕法[17]，略作修改。將RP-250A型智能人工氣候培養(yǎng)箱分5層，中間3層架子鋪上尼龍網(wǎng)，預(yù)先將所有培養(yǎng)箱的內(nèi)部、白瓷盤以及尼龍網(wǎng)等用75%乙醇消毒。用40 cm×30 cm白瓷盤盛滿蒸餾水置于培養(yǎng)箱的最上層和最底層，將培養(yǎng)箱溫度調(diào)至40 ℃，平衡1 d，待培養(yǎng)箱內(nèi)的溫濕度穩(wěn)定在40 ℃、80%相對(duì)濕度。次日，分別將各品種種子單層平鋪于培養(yǎng)箱中間3層，之后每隔0、3、6、9、12、15 d后取出種子并及時(shí)適量補(bǔ)水。最后，將老化處理后的種子置于室溫下自然風(fēng)干，待其含水量降至原始水平后進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.3 萌發(fā)處理及取樣

參照《國際種子檢驗(yàn)規(guī)程》規(guī)定的大麥種子發(fā)芽條件，采用發(fā)芽盒紙上法。從干種子吸水12 h開始至發(fā)芽(72 h)，每隔12 h取樣1次，共取樣6次，各3次重復(fù)。

1.4 淀粉粒的提取

大麥胚乳淀粉粒的提取參照Peng等[18]的方法，并略作修改。隨機(jī)選取萌發(fā)72 h的大麥種子50粒，剝?nèi)シN胚、根和芽，在10 mL 蒸餾水中研磨。將混合物轉(zhuǎn)入50 mL離心管，4 000 g離心5min。移去沉淀上部的黃色膠狀物，過60目篩，并將沉淀懸浮在10 mL H2O中。將懸浮液平鋪在15 mL 80% (m/V)的氯化銫水溶液上(氯化銫的體積是懸浮液體積的2～3倍)，4 000 g離心5 min，移去上清液。重復(fù)2次上述氯化銫離心步驟。用10 mL漂洗緩沖液洗沉淀3～4次，再用水和丙酮漂洗沉淀各3～4次。常溫干燥沉淀，將干燥的淀粉研磨成細(xì)粉，過100目篩，儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 淀粉粒的觀察

淀粉粒類型的變化采用熒光顯微鏡(Olympus BX51，Japan)觀察[19]，淀粉粒表觀特性采用掃描電鏡(Hitachi S570，Japan)觀察，加速電壓3～15 kV。各處理3次重復(fù)，每個(gè)處理觀察10個(gè)視野，取平均值。

1.6 淀粉含量的測(cè)定

淀粉含量采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定[20]，略作修改。

采用Hitachi U-3900紫外分光光度計(jì)測(cè)定淀粉提取液的吸光度值。確定直鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)λ1為554 nm，參比波長(zhǎng)λ2為490 nm；支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)λ3為542 nm，參比波長(zhǎng)λ4為713 nm。各處理3次重復(fù)。

1.7 淀粉酶活性的測(cè)定

淀粉酶活性采用3,5-二硝基水楊酸測(cè)定還原糖的方法[21]。淀粉酶活力的定義為1 min由底物催化生成1 mg還原糖的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。極限糊精酶提取[22]與測(cè)定根據(jù)愛爾蘭Megazyme公司試劑使用說明，各處理3次重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 18.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，SigmaPlot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工老化對(duì)大麥種子胚乳淀粉粒的影響

2.1.1 人工老化對(duì)大麥種子胚乳淀粉粒類型的影響

本研究采用Kang等[3]的方法，將淀粉粒分為大、小2類，即將B和C型統(tǒng)稱為小淀粉粒，A型稱為大淀粉粒。不同品種大麥對(duì)照種子在萌發(fā)72 h時(shí)，胚乳存在大和小2種類型的淀粉粒，且以大淀粉粒為主，小淀粉粒較少。但是隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，各品種種子胚乳中小淀粉粒逐漸增加，大淀粉粒逐漸減少。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，老化15 d甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、

表1 不同活力水平的大麥種子萌發(fā)早期胚乳淀粉粒的類型(n=30)

注：不同小寫字母表示不同老化天數(shù)下差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

P12-8和9810種子胚乳大淀粉粒與對(duì)照相比減少了16.44%、15.85%、30.20%、37.46%，差異達(dá)到顯著水平；老化15 d甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、P12-8、9810種子胚乳小淀粉粒與對(duì)照相比增加了292.09%、285.46%、453.83%、347.21%，差異達(dá)到顯著水平(表1)。

2.1.2 人工老化對(duì)大麥種子胚乳淀粉粒表觀特性的影響

由圖1可知，所有處理的大麥種子胚乳的基本形態(tài)無明顯差異，大淀粉粒為盤狀，小淀粉粒為球狀。未經(jīng)老化的甘啤4號(hào)種子胚乳大淀粉粒赤道出現(xiàn)凹槽和小孔，并被水解成大小不同的空洞，而墾啤7號(hào)、P12-8和9810種子胚乳大淀粉粒出現(xiàn)了較明顯的赤道凹槽和小孔。隨著老化時(shí)間延長(zhǎng)，各品種的種子胚乳淀粉粒赤道凹槽和小孔明顯減少，老化15 d后，各品種大麥種子胚乳淀粉粒表面則較光滑。

注：a為甘啤4號(hào)，b為墾啤7號(hào)，c為P12-8，d為9810；1～4分別為CK、老化3、9、15 d，箭頭所指為淀粉粒表面的赤道凹槽和微孔。 圖1 人工老化處理對(duì)大麥種子萌發(fā)72 h胚乳淀粉粒表觀特性的影響(1 000×)

2.2老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2.1 老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖2可知，4個(gè)品種各處理種子萌發(fā)12 h時(shí)，支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，各品種種子內(nèi)支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照相比分別逐漸增加。老化15 d，萌發(fā)72 h時(shí)的甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、P12-8、9810種子內(nèi)支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照相比分別增加了9.93%、18.01%、20.21%、21.98%，差異達(dá)到顯著水平，而且萌發(fā)72 h時(shí)，墾啤7號(hào)老化處理間(除12、15 d)差異均達(dá)到顯著水平。萌發(fā)48～72 h時(shí)，甘啤4號(hào)種子內(nèi)支鏈淀粉分解較其他3個(gè)品種更少。

注：不同顏色的柱形從左到右依次為CK、老化3、6、9、12、15 d；不同小寫字母表示不同老化天數(shù)下差異達(dá)顯著水平(P

2.2.2 老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖3可知，墾啤7號(hào)各老化處理種子在萌發(fā)12～24 h時(shí)，直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著老化時(shí)間延長(zhǎng)，各品種種子內(nèi)直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照相比分別逐漸增加。老化15 d，萌發(fā)72 h時(shí)的甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、P12-8、9810種子內(nèi)直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對(duì)照相比分別增加了28.88%、15.38%、16.08%、30.89%，差異達(dá)到顯著水平。老化15 d的P12-8種子在萌發(fā)48～72 h，其支鏈淀粉分解較其他3個(gè)品種更少。

圖3 老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.3 老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子淀粉酶活性的影響

2.3.1 老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子α-淀粉酶活性的影響

由圖4可知，隨著老化程度的加深，α-淀粉酶活性逐漸降低。老化15 d的墾啤7號(hào)種子在萌發(fā)12 h時(shí)未檢測(cè)到α-淀粉酶活性，甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、P12-8、9810種子內(nèi)檢測(cè)到了少量低活力值的α-淀粉酶，各老化處理與對(duì)照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同老化水平的甘啤4號(hào)種子在萌發(fā)24 h時(shí)，α-淀粉酶活性與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平，且不同老化處理間差異達(dá)到顯著水平。老化15 d的甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、P12-8、9810種子在萌發(fā)72 h時(shí)，種子內(nèi)α-淀粉酶活性與對(duì)照相比分別降低了58.39%、44.11%、48.68%、49.96%，差異達(dá)到顯著水平。

圖4 人工老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子α-淀粉酶活性的影響

2.3.2 老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子β-淀粉酶活性的影響

由圖5可知，隨著老化程度的加深，β-淀粉酶活性逐漸降低。4個(gè)品種各處理的種子在萌發(fā)12 h時(shí)，均檢測(cè)到了低活力值的β-淀粉酶。各品種老化9 d的種子在萌發(fā)在萌發(fā)24～72 h時(shí)，β-淀粉酶活性顯著低于對(duì)照。老化15 d的甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、P12-8、9810種子在萌發(fā)72 h時(shí)，β-淀粉酶活性與對(duì)照相比分別降低了50.99%、37.40%、58.52%、53.77%，差異達(dá)到顯著水平。

圖5 人工老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子β-淀粉酶活性的影響

2.3.3 老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子極限糊精酶活性的影響

由圖6可知，隨著老化程度的加深，極限糊精酶活性逐漸降低。老化15 d，萌發(fā)12 h的甘啤4號(hào)和墾啤7號(hào)種子內(nèi)極限糊精酶活性與對(duì)照相比，差異達(dá)到顯著水平，而P12-8和9810種子內(nèi)極限糊精酶活性與對(duì)照相比，無顯著差異。萌發(fā)12～36 h，4個(gè)品種種子內(nèi)極限糊精酶活性緩慢增加，萌發(fā)36 h以后，甘啤4號(hào)和墾啤7號(hào)種子內(nèi)極限糊精酶活性迅速增加，而萌發(fā)48 h以后，甘啤4號(hào)和墾啤7號(hào)種子內(nèi)極限糊精酶活性迅速增加。老化15 d，萌發(fā)72 h時(shí)的甘啤4號(hào)、墾啤7號(hào)、P12-8、9810種子內(nèi)極限糊精酶活性與對(duì)照相比分別降低了77.52%、70.33%、82.59%、68.60%，差異達(dá)到顯著水平。

圖6 人工老化對(duì)萌發(fā)早期大麥種子極限糊精酶活性的影響

3 討論

3.1 人工老化對(duì)淀粉的影響

種子吸水后，其糊粉層和盾片上皮層會(huì)合成一系列水解酶，這些酶分泌到淀粉胚乳中，分解細(xì)胞壁與貯藏的淀粉[23]。萌發(fā)過程中，胚乳淀粉粒的直徑逐漸變小，其表面赤道凹槽和小孔部分更易被酶解，總淀粉粒的酶解效率和大淀粉粒含量呈正相關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)老化處理的各品種大麥種子在萌發(fā)72 h時(shí)，胚乳均有大、小淀粉粒，且以大淀粉粒為主，大淀粉粒較少。但是隨著老化程度加深，各品種種子胚乳中小淀粉粒逐漸增加，大淀粉粒逐漸減少，說明，老化處理會(huì)導(dǎo)致大麥種子胚乳大、小淀粉粒的數(shù)目發(fā)生變化。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)老化處理后大淀粉粒為盤狀，小淀粉粒為球狀，這與銀永安等[25]和韋存虛等[5]報(bào)道的結(jié)果相似。但是，隨著老化時(shí)間延長(zhǎng)，種子胚乳大淀粉粒赤道凹槽和小孔明顯減少，老化15 d后，各品種大麥種子胚乳淀粉粒表面則較光滑，由此表明，老化處理未改變大麥胚乳淀粉粒的基本形態(tài)特征，但對(duì)其表觀特性有一定影響。此外，本研究發(fā)現(xiàn)同一萌發(fā)時(shí)間，老化程度越深，4個(gè)品種種子內(nèi)支鏈淀粉和直鏈淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均增加的趨勢(shì)，這與蔡秋華等[26]在水稻上研究相似。究其原因，可能是隨著老化程度的加深，淀粉酶的合成或釋放過程受到影響，使淀粉酶的活性受到抑制，從而導(dǎo)致胚乳淀粉粒分解延緩，支鏈淀粉和直鏈淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。

3.2 人工老化對(duì)淀粉酶的影響

α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶的活性在萌發(fā)大麥種子中均呈增加趨勢(shì)[16]，而老化會(huì)引起種子內(nèi)酶活力改變。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同萌發(fā)時(shí)間，老化處理后的大麥種子中α-淀粉酶的酶活性呈降低的趨勢(shì)。這可能是由于隨著老化程度的加深，大麥種子糊粉層中α-淀粉酶的合成過程受到影響，或是糊粉層細(xì)胞壁釋放α-淀粉酶的過程受到了抑制[27]。其次，研究發(fā)現(xiàn)老化程度越深，β-淀粉酶的酶活性呈降低的趨勢(shì)，而且將α-淀粉酶與β-淀粉酶活性變化趨勢(shì)進(jìn)行比較，β-淀粉酶活性降低的趨勢(shì)更明顯。這可能是自由態(tài)β-淀粉酶發(fā)生了部分降解或失活[28]，或是蛋白酶介導(dǎo)的種子萌發(fā)束縛態(tài)β-淀粉酶的釋放過程受阻[29]。此外，隨著老化程度的加深，極限糊精酶的活性呈降低的趨勢(shì)，該酶主要作用是水解被α-淀粉酶和β-淀粉酶聯(lián)合降解淀粉后形成的較小的分支寡糖，其活性可能受α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的降低的影響。還有大麥種子在萌發(fā)過程中合成的極限糊精酶與種子中的不可溶性物質(zhì)結(jié)合形成無活性的形式，而成熟種子胚和胚乳中存在含量較高的極限糊精酶抑制因子[30]，老化可能促使抑制因子的增加從而抑制了極限糊精酶的活性。

4 結(jié)論

人工老化降低了淀粉酶活性，淀粉粒降解延緩，從而導(dǎo)致大麥種子萌發(fā)早期淀粉的分解受到抑制。本試驗(yàn)僅研究了老化處理對(duì)大麥種子淀粉分解的生理生化變化，對(duì)引起淀粉酶活性變化內(nèi)在原因還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Aging on Starch and Amylase Activity of Barley Seeds in Early Germination

Wang Feng Qi Juncang Guo Yanan Zheng Xuguang Gong Lei Wang Shaoyu Chen Along Huang Xiangyi Li Zhonghao Song Ruijiao

(College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi 832003)

This study was to explore the effect of aging on starch granule, starch content and amylase activity of barley seeds with high temperature and high humidity artificial aging treatment in the early stage of germination. The results showed that artificial aging had no effect on barley endosperm starch granule on the basis of morphological characteristics. However, it increased the small starch granules and reduced large starch granules of endosperm. Besides, the equatorial grooves and pin holes at the surfaces of the large starch granules decreased significantly in the germination 72 h. In addition, artificial aging induced the increasing of amylopectin and amylose content and reduced the activity of α-amylase and β-amylase. There were significant differences in starch content and amylase activity of all barley between the aging 15 d and control. It could be concluded that aging reduced amylase activity and the degradation of the starch was mitigated consequently, which resulted in the inhibition of starch mobilization of barley seed in the early stage germination.

barley, artificial aging, early germination, starch depolymerization

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)(CARS-05)，石河子大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(gxjs2015-yz02)

2016-05-31

王鳳，女，1991年出生，碩士，大麥種子生理

齊軍倉，男，1971年出生，教授，大麥遺傳育種與栽培技術(shù)

S512.1；S311

：A

：1003-0174(2017)08-0014-08